DBNDD1与浸润性乳腺癌预后及免疫标志物的关联

Association of DBNDD1 with prognostic and immune biomarkers in invasive breast cancer.

作者信息Xinzhu Huang, Yiyang Wang, Junyi Wang, Yubo Jing, Elihamu Dilraba, Yongxiang Li, Chenming Guo
PMID39979699
发布时间2025-02
DOI10.1007/s12672-025-01990-w

实验完整度

本研究结合了生物信息学分析(多种数据库)和体外细胞实验(增殖、凋亡、侵袭迁移),但缺乏动物模型和临床样本的进一步验证。

主要模型

TCGA-BRCA数据集 MDA-MB-231人乳腺癌细胞系 MDA-MB-468人乳腺癌细胞系

重点核对

DBNDD1在TCGA-BRCA IBC样本中的mRNA表达水平(中位数分组高/低) DBNDD1蛋白表达水平(CPTAC数据库和HPA免疫组化) 体外实验使用MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系,经STR鉴定 DBNDD1过表达质粒转染,72小时后检测 细胞增殖检测(CCK-8)在0, 24, 48, 72小时进行

摘要

背景:含Dysbindin结构域的蛋白1(DBNDD1)与恶性肿瘤的发生发展密切相关,但其在浸润性乳腺癌(IBC)中的功能和机制仍知之甚少。我们的目标是确定DBNDD1在IBC中可能的诊断和预后意义。方法:利用相关数据库分析IBC中DBNDD1表达水平与临床病理特征之间的关系,并评估DBNDD1在IBC诊断和预后中的作用。我们探讨了可能的细胞机制和生物学功能,以及DBNDD1相关的相互作用蛋白,分析了DBNDD1甲基化状态,并研究了其与免疫细胞浸润的相关性。体外研究了DBNDD1对乳腺癌(BC)细胞功能的影响。结果:DBNDD1 mRNA和蛋白水平在IBC中高表达,并与较差的预后显著相关。DBNDD1低甲基化状态与不良预后相关。富集分析显示,与DBNDD1表达呈正相关的基因主要富集在与DNA合成和DNA甲基化相关的通路中。此外,DBNDD1表达水平与组织中的免疫细胞浸润显著相关。经体外实验验证,DBNDD1过表达可促进BC细胞的增殖、侵袭和迁移,并抑制BC细胞凋亡。结论:DBNDD1上调与肿瘤免疫细胞浸润和不良IBC预后直接相关。DBNDD1具有作为诊断和预测疾病结果的生物标志物的能力,以及作为IBC治疗干预的潜在靶点。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
DBNDD1在浸润性乳腺癌中的表达及其诊断和预后价值如何,以及它对乳腺癌细胞功能的影响是什么?
核心机制
DBNDD1的过表达可能通过影响DNA合成和DNA甲基化通路,以及调节肿瘤免疫微环境(如影响Th1/Th2平衡和巨噬细胞极化)来促进IBC进展和不良预后。
主要证据
基于TCGA、GEO、CPTAC等数据库分析显示DBNDD1在IBC中高表达且与不良预后相关;体外实验表明DBNDD1过表达促进乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移,并抑制凋亡。
研究意义
DBNDD1可能成为IBC的诊断和预后生物标志物,以及潜在的免疫治疗靶点,为癌症免疫治疗提供新思路。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

DBNDD1表达差异分析

评估DBNDD1在IBC和正常组织中的表达差异。

利用TIMER和TCGA数据库分析多种肿瘤中DBNDD1 mRNA表达,并从TCGA-BRCA获取RNAseq数据及临床信息,比较IBC与正常组织的表达差异,并用GEO数据集验证。

2

DBNDD1蛋白表达验证

验证DBNDD1蛋白在IBC中的表达水平。

利用CPTAC数据库分析DBNDD1蛋白表达,并用HPA数据库的免疫组化结果确认其在IBC和正常组织中的表达。

3

临床病理特征关联分析

探讨DBNDD1表达与IBC患者临床病理特征的关系。

根据DBNDD1表达中位数将TCGA-BRCA样本分为高低组,分析其与T分期、N分期、年龄、ER/PR状态等的相关性。

4

预后生存分析

评估DBNDD1表达与IBC患者生存预后的关系。

使用Kaplan-Meier分析和log-rank检验评估OS、RFS、DMFS等生存指标,并用GEO数据集验证。

5

诊断价值分析

评估DBNDD1作为IBC诊断标志物的潜力。

通过ROC曲线分析评估DBNDD1 mRNA表达区分IBC与正常组织的效能。

6

PPI网络和富集分析

探索DBNDD1的相互作用蛋白和富集通路。

利用STRING构建PPI网络,进行GO/KEGG富集分析和GSEA分析。

7

甲基化分析

评估DBNDD1启动子甲基化状态及其对预后的影响。

使用UALCAN和MethSurv数据库分析DBNDD1启动子甲基化,并分析CpG位点甲基化与OS的关系。

8

免疫细胞浸润分析

探讨DBNDD1表达与肿瘤免疫细胞浸润的关系。

使用TIMER数据库分析六种免疫细胞浸润,并用ssGSEA算法分析24种免疫细胞浸润。

9

体外细胞功能实验

验证DBNDD1对乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。

在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中过表达DBNDD1,通过CCK-8、流式细胞术和Transwell实验检测细胞功能。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
胎牛血清Gibco10091148
青霉素-链霉素HycloneSV30010
脂质体----
TRIZOL试剂Ambion15596-018
RQ1 DNasePromegaM6101
逆转录试剂盒VazymeR323-01
QuantStudio 5ABI--
RIPA裂解液ProteintechPR20001
蛋白酶抑制剂混合物Sigma4693116001
蛋白上样缓冲液SolarbioP1040
PVDF膜MilliporeISEQ00010
DBNDD1抗体abcamb108629
GAPDH抗体Proteintech60004-1-Ig
HRP标记二抗ProteintechSA00001-2
HRP标记二抗ABclonalAS003
ECL发光液BeyotimeP0018FM
细胞计数试剂盒-8Yeasen40203 ES 76
Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒Yeasen40304 ES 60
FACSCanto流式细胞仪BD--
Transwell小室Corning3422
基质胶----
结晶紫BeyotimeC0121
MDA-MB-231细胞系Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0150B
MDA-MB-468细胞系Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0290A

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
数据库分析
TCGA-BRCA数据集患者分组依据(DBNDD1表达中位数);临床病理特征统计方法(χ2或Fisher检验)。
阅读提示:见Materials and methods: Data collection and differential analysis of DBNDD1 expression; Statistical analysis
细胞培养
细胞系来源和STR鉴定;培养基成分(10% FBS, 100 μg/mL链霉素, 100 U/mL青霉素);培养条件(37°C, 5% CO2)。
阅读提示:见Materials and methods: Cell culture and transfection
细胞转染
转染试剂(Lipofectamine);转染后收集时间点(72小时)。
阅读提示:见Materials and methods: Cell culture and transfection; Figure 11 legend
RNA提取和RT-qPCR
RNA提取方法(TRIZOL);逆转录条件(42°C 5min, 37°C 15min, 85°C 5s);qPCR条件(95°C 10min, 40 cycles 95°C 15s, 60°C 1min);内参基因(GAPDH);数据分析方法(2-ΔΔCT)。
阅读提示:见Materials and methods: RNA extraction and real-time PCR
Western blotting
蛋白裂解液(RIPA);抗体稀释比例(anti-DBNDD1 1:1000, anti-GAPDH 1:10000);二抗稀释比例(1:10000);封闭和孵育时间。
阅读提示:见Materials and methods: Western blotting
细胞增殖
CCK-8实验细胞接种密度(具体数量未明确);检测时间点(0, 24, 48, 72小时);孵育时间(3小时);波长(450nm)。
阅读提示:见Materials and methods: Cell proliferation and apoptosis experiments; Figure 11D-G
细胞凋亡
Annexin V-APC和PI染色时间(各15分钟);流式细胞仪型号。
阅读提示:见Materials and methods: Cell proliferation and apoptosis experiments; Figure 11H-I
细胞侵袭和迁移
Transwell小室规格(8μm);有无基质胶;下室加入600μL 10% FBS培养基;孵育时间(24小时);固定和染色条件(4%多聚甲醛30分钟,0.1%结晶紫)。
阅读提示:见Materials and methods: Cell invasion and migration assay; Figure 11J-M