CRISPR筛选
鉴定影响DAC敏感性和耐药性的基因
HAP1-Cas9-F5细胞转导CRISPR库，DAC或DMSO处理10天，每两天收集样本进行测序。
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CRISPR-Cas9筛选揭示地西他滨细胞反应的遗传决定因素
A CRISPR-Cas9 screen reveals genetic determinants of the cellular response to decitabine.
实验完整度
高包含全基因组CRISPR筛选、功能验证（细胞活力、γH2A.X）、机制研究（ChIP-seq、RNA-seq、蛋白质组学）及体内外模型。
主要模型
HAP1细胞系 U2OS细胞系 乳腺癌细胞系（MDA-MB-436、HCC1937等）
重点核对
DAC浓度：500 nM（筛选） DAC脉冲浓度：10 μM，30分钟 DCTD敲除对DAC敏感性的影响 DNMT1表达水平与DAC敏感性相关性 KDM1A敲除对DAC敏感性的影响
摘要
地西他滨（DAC），一种公认的DNA低甲基化剂，已被用于治疗急性髓系白血病。然而，临床研究表明DNA甲基化减少与临床反应不相关，且复发普遍存在。为了更深入地了解其抗肿瘤机制，我们进行了时间分辨的CRISPR-Cas9筛选，以识别控制DAC反应的因子。我们发现由DNMT-DNA加合物和通过dCMP脱氨酶DCTD产生的5-氮杂-dUTP错误掺入引起的DNA损伤，是DAC诱导的急性细胞毒性的驱动因素。在下一个S期出现的DNA损伤依赖于DNA复制，揭示了DAC对基因组稳定性的跨细胞周期效应。通过探索合成致死的候选基因，我们意外地发现，KDM1A通过与ZMYM3和CoREST的相互作用促进DAC处理后的存活，这与其去甲基化酶活性或病毒模拟调节无关。这些发现强调了DNA修复途径在DAC反应中的重要性，并提供了潜在的生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DAC抗肿瘤作用的主要机制是什么，哪些基因决定细胞对DAC的反应？
- 核心机制
- DAC诱导的DNA损伤（DNMT-DNA加合物和5-aza-dUTP错误掺入）驱动细胞毒性，而非DNA去甲基化；KDM1A通过独立于其酶活性的DNA修复作用促进细胞存活。
- 主要证据
- 全基因组CRISPR筛选、DCTD和DNMT1功能验证、γH2A.X免疫染色、DR-GFP/EJ7-GFP报告系统、ChIP-seq和质谱分析。
- 研究意义
- 为DAC治疗提供潜在生物标志物，并提出联合靶向KDM1A降解与DAC的合成致死策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DCTD验证
验证DCTD缺失对DAC敏感性的影响
HAP1和Jurkat细胞敲除DCTD，检测DAC剂量反应曲线。
DNA修复缺陷敏感性
评估DNA修复缺陷是否增加DAC敏感性
敲除FA基因和CTDNEP1，检测DAC敏感性；使用DR-GFP和EJ7-GFP报告系统测量HR和NHEJ效率。
DNMT1和UHRF1作用
研究DNMT1和UHRF1对DAC诱导DNA损伤的影响
敲除DNMT1或UHRF1，测量DAC敏感性、γH2A.X水平及DNMT1蛋白水平。
DAC诱导DNA损伤的周期效应
验证DAC诱导的DNA损伤是否依赖下一个S期的DNA复制
U2OS细胞用胸苷同步化，DAC脉冲后检测γH2A.X和EdU标记。
KDM1A功能验证
确定KDM1A在DAC反应中的作用
敲除KDM1A，检测DAC敏感性；回补野生型或催化失活突变体；域扫描；ChIP-seq和蛋白质组学。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | HAP1细胞 | Horizon | C631 |
| HEK293FT细胞 | Procell | CL-0313 | |
| JeKo-1细胞 | Procell | CL-0128 | |
| Jurkat E6细胞 | Procell | CL-0129 | |
| U2OS细胞 | Cell Resource Center, Peking Union Medical College | 1101HUM-PUMC000028 | |
| T47D细胞 | Procell | CL-0228 | |
| BT549细胞 | Procell | CL-0041 | |
| HCC1937细胞 | Procell | CL-0093 | |
| SKBR3细胞 | Procell | CL-0211 | |
| ZR75-1细胞 | Procell | CL-0247 | |
| BT474细胞 | Procell | CL-0040 | |
| MDA-MB-436细胞 | Procell | CL-0383 | |
| 载体构建 | lentiCRISPRv2载体 | Addgene | #52961 |
| LentiGuide载体 | Addgene | #52963 | |
| pLenti-EF1A-PGK-puro载体 | -- | -- | |
| AAVS1-Neo-CAG-Flpe-ERT2载体 | Addgene | #68460 | |
| 抗体 | DCTD抗体 | Santa Cruz | sc-376659 |
| DNMT1抗体 | Santa Cruz | sc-20701 | |
| DNMT1抗体 | ABclonal | A16729 | |
| UHRF1抗体 | Santa Cruz | sc-373750 | |
| KDM1A抗体 | ABcam | ab17721 | |
| γH2A.X抗体 | ABcam | ab22551 | |
| γH2A.X抗体 | ABcam | ab2893 | |
| RPA32抗体 | Santa Cruz | sc-56770 | |
| ZMYM2抗体 | Thermo Scientific | PA5-28265 | |
| ZMYM3抗体 | Thermo Scientific | PA5-51862 | |
| RCOR1抗体 | Sigma | 07-455 | |
| RCOR2抗体 | ABcam | ab37113 | |
| HDAC1抗体 | Proteintech | 6085-1-Ig | |
| ACTB抗体 | ABclonal | AC026 | |
| GFP抗体 | ABclonal | AE011 | |
| GFP抗体 | ABcam | ab13970 | |
| GFP抗体 | MBL | 598 | |
| H3抗体 | ABclonal | A2348 | |
| FLAG抗体 | Sigma | B3111 | |
| PARylation抗体 | Santa Cruz | sc-56198 | |
| XRCC1抗体 | ABclonal | A0442 | |
| Alexa Fluor Plus 555标记的山羊抗鼠IgG (H+L) | Thermo Scientific | A32727 | |
| Alexa Fluor 647标记的驴抗兔IgG (H+L) | Thermo Scientific | A31573 | |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗鼠IgG (H+L) | Thermo Scientific | A32723 | |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗鸡IgY (H+L) | ABcam | ab150169 | |
| HRP标记的驴抗鼠IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-8 | |
| HRP标记的驴抗兔IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-9 | |
| 药物处理 | 地西他滨 | Selleck | S1200 |
| ORY-1001 | Selleck | S7795 | |
| GSK2879552 | Selleck | S7796 | |
| AZD-7648 | Selleck | S8843 | |
| GSK3484862 | TargetMol | T11469 | |
| 胸苷 | Sigma | T1895 | |
| FKBP12 PROTAC dTAG-13 | MCE | HY-114421 | |
| Zeocin | Thermo Scientific | R25001 | |
| 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr | |
| 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | ant-bl | |
| 潮霉素 | VWR | 97064-454 | |
| G418 | Inalco Pharmaceuticals | 1758-1811 | |
| 染色 | Hoechst 33342 | Lablead | B2261 |
| 分子克隆 | BsmBI限制酶 | NEB | R0580 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Scientific | 15596026 |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo试剂盒 | Promega | G7573 |
| 细胞增殖检测 | EdU细胞增殖检测试剂盒 | Baseclick | BCK-EdU555 |
| BeyoClick EdU细胞增殖试剂盒 | Beyotime | C0081S | |
| 蛋白质相互作用 | Duolink原位检测试剂盒（红色） | Sigma | DUO92008 |
| 测序文库构建 | KAPA Hyper Prep试剂盒 | Roche | KK8504 |
| 显微镜 | Opera Phoenix高内涵筛选系统 | PerkinElmer | -- |
| LSM980共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 质谱 | Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Easy n-LC 1200高效液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | BD FACSCalibur流式细胞仪 | BD | -- |
| 超声破碎 | Covaris M220超声破碎仪 | Covaris | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | HAP1-Cas9-F5细胞，MOI=0.3，DAC浓度500 nM，处理时间10天，两个重复。 阅读提示：参见Methods中的Genome-wide CRISPR KO screen。 |
| DCTD验证 | DCTD敲除克隆，DAC处理时间3天，胸苷添加浓度（HAP1 50 μM，Jurkat 10 μM）。 阅读提示：参见Results中“Depletion of DCTD leads to cellular resistance to DAC”及图1H,I。 |
| DNA修复缺陷敏感性 | FA基因敲除（FANCA, FANCD2, FANCL, UBE2T），CTDNEP1敲除，HR和NHEJ报告系统。 阅读提示：参见Results中“Defects in DNA repair pathways sensitize cells to DAC”及图2。 |
| DNMT1和UHRF1作用 | DNMT1或UHRF1敲除，DAC浓度500 nM，处理时间，DNMT1蛋白水平，γH2A.X信号。 阅读提示：参见Results中“Prior DNA demethylation and reduction in DNMT1 protein abundance”及图3。 |
| DAC诱导DNA损伤的周期效应 | 胸苷同步化（2 mM，18-20 h），DAC脉冲（10 μM，30 min），γH2A.X和EdU标记。 阅读提示：参见Results中“DAC induces an extensive DNA damage response in the second S phase”及图4。 |
| KDM1A功能验证 | KDM1A敲除，回补质粒（WT、AE/KA、3DA、ΔNFR、ΔSWIRM、ΔTOWER），DAC浓度，处理时间。 阅读提示：参见Results中“Loss of KDM1A but not its catalytical activity increases sensitivity to DAC”及图5。 |