构建融合蛋白表达载体
构建MCM2-V5-APEX2融合蛋白表达载体，用于后续的邻近标记。
将Mcm2基因与V5标签和APEX2融合，克隆到pLX304载体，包含氨苄青霉素和杀稻瘟菌素抗性标记。
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利用基于APEX2的邻近标记技术鉴定与复制起始相关的MCM2相互作用蛋白
Identification of MCM2-Interacting Proteins Associated with Replication Initiation Using APEX2-Based Proximity Labeling Technology.
实验完整度
高包含细胞模型构建、邻近标记、质谱鉴定、功能验证（BiFC）等多个证据层级，且具有明确的功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠E14TG2a胚胎干细胞 小鼠NIH/3T3成纤维细胞 HEK293T细胞
重点核对
细胞同步化处理：双胸苷阻断，2 mM胸苷处理16小时，释放7小时，再处理16小时 APEX2标记条件：100 μM生物素-苯酚孵育30分钟，加入1 mM H2O2反应1分钟 质谱分析：两个生物学重复，log2 FC > 1筛选阳性蛋白 BiFC验证：MCM2-N154与候选蛋白C155共转染HEK293T细胞
摘要
DNA复制是一个关键的生物学过程，确保遗传信息的准确传递，支撑生物体的生长、发育和繁殖。DNA复制异常是基因组不稳定和肿瘤发生的主要来源。在DNA复制过程中，前复制复合物（pre-RC）在G1-G1/S转换期的组装是确保复制成功起始的关键许可步骤。尽管已经鉴定了许多前复制复合物（pre-RC）蛋白，但技术限制阻碍了瞬时相互作用蛋白的检测。APEX系统利用过氧化物酶介导的快速标记，具有高催化效率，能够在一分钟内实现蛋白标记并检测瞬时蛋白相互作用。MCM2是真核生物复制起始复合物的关键组分，对DNA复制至关重要。在本研究中，我们将MCM2与增强型APEX2融合，进行原位生物素化。通过结合质谱分析，我们鉴定了同步化的小鼠胚胎干细胞（ESCs）和NIH/3T3中复制起始复合物附近的蛋白。通过比较两种细胞类型的结果，我们鉴定了一些候选蛋白。通过双分子荧光互补实验确认了MCM2与候选蛋白CD2BP2、VRK1和GTSE1之间的相互作用。这项研究为进一步研究保守的DNA复制起始复合物的组成蛋白及其邻近蛋白的瞬时调控网络奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MCM2附近存在哪些瞬时相互作用蛋白，这些蛋白如何参与DNA复制起始？
- 核心机制
- MCM2与CD2BP2、VRK1和GTSE1存在相互作用，CD2BP2可能通过招募PP1防止MCM2-7过度磷酸化，VRK1可能通过调节组蛋白H3和H4乙酰化影响MCM2-7装载，GTSE1可能通过下调p53和p21调节CDK活性防止重复复制。
- 主要证据
- 通过APEX2邻近标记和质谱鉴定，在ESC和NIH/3T3细胞中发现147个共同蛋白；BiFC实验确认MCM2与CD2BP2、VRK1和GTSE1的相互作用。
- 研究意义
- 该研究为理解DNA复制起始复合物的组成和瞬时调控网络提供了新方法与依据，有助于进一步研究哺乳动物DNA复制过程。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立稳定表达细胞系
获得稳定表达MCM2-V5-APEX2融合蛋白的小鼠ESC和NIH/3T3细胞系。
利用慢病毒感染，通过杀稻瘟菌素（10 μg/mL）筛选稳定细胞系，并通过Western blot验证融合蛋白表达。
验证融合蛋白活性
验证MCM2-V5-APEX2融合蛋白具有APEX2酶活性并能标记邻近蛋白。
用H2O2和生物素-苯酚处理细胞，通过免疫荧光检测V5和生物素信号共定位。
细胞周期同步化
使细胞同步于G1/S期，以富集复制起始复合物。
使用双胸苷阻断法同步细胞，通过流式细胞术验证同步效果。
APEX2邻近标记
在活细胞中标记MCM2邻近蛋白。
同步化细胞与生物素-苯酚孵育，加入H2O2启动标记反应，然后淬灭。
链霉亲和素富集
富集生物素化的蛋白，用于质谱鉴定。
细胞裂解后，使用链霉亲和素琼脂糖珠子富集生物素化蛋白，并通过Western blot验证富集效果。
质谱鉴定
鉴定与MCM2邻近的蛋白。
珠子上的蛋白经酶解后进行LC-MS/MS分析，数据处理使用MaxQuant。
数据分析与候选蛋白筛选
从质谱数据中筛选与DNA复制起始相关的候选蛋白。
比较ESC和NIH/3T3的阳性蛋白，取交集获得147个蛋白；与HPA数据库中的细胞周期依赖蛋白比较，获得11个蛋白；使用STRING数据库进行PPI网络分析。
BiFC验证
验证MCM2与候选蛋白之间的物理相互作用。
将MCM2与mScarlet3的N端部分融合，候选蛋白与C端部分融合，共转染HEK293T细胞，通过荧光观察相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Gibco | Waltham, |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | Waltham, | |
| GlutaMAX | Gibco | Waltham, | |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | Waltham, | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | St. | |
| 小鼠白血病抑制因子 | Millipore | Burlington, | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | Waltham, | |
| 高糖DMEM | Not specified | -- | |
| 青霉素 | Not specified | -- | |
| 链霉素 | Not specified | -- | |
| 分子克隆 | pLX304-Flag-APEX2-NES质粒 | Addgene | 92158 |
| NovoRec®一步PCR克隆试剂盒 | Novoprotein | NR005 | |
| 细胞构建 | PSPAXZ包装质粒 | -- | -- |
| PMD2.G包装质粒 | -- | -- | |
| 杀稻瘟菌素 | -- | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Cell Signaling Technology | 9806 |
| Western blot | MCM2抗体 | Cell Signaling Technology | 3619 |
| β-Actin抗体 | Beyotime | AF0003 | |
| V5标签抗体 | Cell Signaling Technology | D3H8Q | |
| HRP标记的山羊抗小鼠抗体 | Beyotime | A0216 | |
| HRP标记的山羊抗兔抗体 | Beyotime | A0208 | |
| ECL发光液 | Beyotime | P0018FM | |
| 细胞周期同步化 | 胸苷 | Sigma | T1895 |
| 碘化丙啶 | Sigma | P4170 | |
| RNase A | Sigma | R5503 | |
| APEX2标记 | 过氧化氢 | -- | -- |
| 免疫荧光 | V5标签抗体 | Cell Signaling Technology | D3H8Q |
| 驴抗兔IgG H&L | Invitrogen | A32790 | |
| 山羊抗兔IgG H&L | Invitrogen | 35561 | |
| Alexa Fluor 594链霉亲和素偶联物 | Invitrogen | S11227 | |
| Alexa Fluor 488链霉亲和素偶联物 | Invitrogen | S11223 | |
| Hoechst染料 | -- | -- | |
| 显微镜 | A1R共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 蛋白质富集 | 链霉亲和素-琼脂糖珠子 | GE Healthcare | 17-5113-01 |
| 链霉亲和素-HRP | Bio-Tech | A0303 | |
| Western blot | Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | 1705060 |
| 蛋白质印迹成像 | ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- |
| 质谱样品制备 | 三(2-羧乙基)膦 | ThermoFisher Scientific | 77720 |
| 氯乙酰胺 | Sigma | 194921 | |
| 内肽酶 | Wako Pure Chemical Industries | 125-05061 | |
| 胰蛋白酶 | Promega | V5280 | |
| 质谱分析 | Ultimate 3000 RSLCnano系统 | ThermoFisher Scientific | -- |
| Orbitrap Q-Exactive HF质谱仪 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 数据分析 | MaxQuant软件 | -- | 1.6.10.43 |
| FlowJo软件 | -- | 10.8.1 | |
| Python | -- | 3.8.3 | |
| Metascape在线工具 | -- | -- | |
| Cytoscape软件 | -- | 3.8.2 | |
| BiFC | pcDNA3.1(+) Lifeact-mScarlet3-HA质粒 | -- | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000008 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与同步化 | 细胞系来源：ESC和NIH/3T3；培养基成分；同步化方案（双胸苷阻断，2 mM胸苷处理16小时，释放7小时，再处理16小时）；细胞融合度（60-70%） 阅读提示：Materials and Methods 4.1 和 4.5 |
| APEX2邻近标记 | 生物素-苯酚浓度（100 μM）；孵育时间（30分钟）；H2O2浓度（1 mM）；反应时间（1分钟）；淬灭缓冲液成分（10 mM Trolox、20 mM抗坏血酸钠、20 mM叠氮化钠） 阅读提示：Materials and Methods 4.6 |
| 链霉亲和素富集 | 珠子类型（链霉亲和素-琼脂糖）；珠子体积（50 μL）；蛋白量（800 μg）；孵育时间（4小时）；洗涤缓冲液组成 阅读提示：Materials and Methods 4.8 |
| 质谱鉴定 | 酶解条件（TCEP、CAA、内肽酶、trypsin）；LC-MS/MS参数（梯度、分辨率、碰撞能量）；数据筛选标准（log2 FC > 1） 阅读提示：Materials and Methods 4.9-4.11 |
| BiFC验证 | 质粒构建（N154和C155融合）；转染试剂（Lipofectamine 3000）；转染量（1.0 μg总DNA/孔）；观察时间（转染后16-24小时） 阅读提示：Materials and Methods 4.12 |