筛选和验证RNF112在CRC中的表达
确定RNF112在CRC组织和细胞中的表达水平及其与临床病理特征的相关性。
通过mRNA测序和生物信息学分析筛选差异表达基因，并用RT-qPCR、Western blot和免疫组化检测RNF112在CRC组织和细胞中的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
转录受KLF4调控的RNF112通过促进NAA40泛素依赖性降解抑制结直肠癌生长
RNF112, whose transcription is regulated by KLF4, inhibits colorectal cancer growth via promoting ubiquitin-dependent degradation of NAA40.
实验完整度
高包含临床样本分析、体外功能实验、裸鼠移植瘤模型、转录调控和泛素化机制验证等多个独立证据层级。
主要模型
结直肠癌细胞系SW620、DLD1 正常结肠上皮细胞系NCM460 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型 结直肠癌患者组织样本
重点核对
RNF112在CRC组织和细胞中的表达情况 RNF112过表达/敲低对细胞活力、周期和凋亡的影响 KLF4对RNF112启动子转录调控的直接证据 RNF112与NAA40的结合及泛素化降解实验 NAA40过表达对RNF112功能的回补实验
摘要
背景：环指蛋白112（RNF112）在人类肿瘤中发挥关键作用。然而，其在结直肠癌（CRC）中的生物学功能尚未被探讨。我们旨在探讨RNF112在CRC中的功能和分子机制。结果：本研究中，RNF112在CRC组织和细胞中的表达显著降低。临床分析显示，RNF112低表达与肿瘤大小、N分期和TNM分期显著相关。体外实验表明，过表达RNF112抑制细胞活力，促进细胞周期阻滞和凋亡，而敲低RNF112具有相反的作用。裸鼠体内成瘤实验结果支持RNF112过表达通过抑制细胞生长和促进细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。机制上，Krüppel样因子4（KLF4）作为RNF112的上游调控因子介导其转录。此外，我们探讨了RNF112的下游机制，发现其通过泛素连接酶活性促进致癌蛋白N-α-乙酰转移酶40（NAA40）的泛素化和降解。另外，过表达NAA40消除了RNF112过表达对CRC肿瘤发生的影响。结论：总之，我们的研究结果证实，转录受KLF4调控的RNF112通过促进NAA40的泛素依赖性降解抑制CRC生长。我们揭示了KLF4-RNF112-NAA40轴在CRC中的作用机制，为该疾病的治疗策略提供了启示。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RNF112在结直肠癌中的生物学功能及其分子机制是什么？
- 核心机制
- KLF4作为转录因子调控RNF112的表达，RNF112通过其E3泛素连接酶活性促进NAA40的泛素化和降解，从而抑制CRC细胞生长和增殖。
- 主要证据
- 通过临床样本分析、体外功能实验（CCK8、流式、蛋白印迹）、裸鼠移植瘤模型、荧光素酶报告基因和Ch-IP实验、Co-IP和泛素化实验等证实了KLF4-RNF112-NAA40轴的作用。
- 研究意义
- 揭示了KLF4-RNF112-NAA40轴在CRC中的重要性，为CRC的诊断或治疗提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能实验
探究RNF112对CRC细胞活力、细胞周期和凋亡的影响。
在SW620和DLD1细胞中过表达或敲低RNF112，通过CCK8检测细胞活力，流式细胞术检测细胞周期和凋亡，并检测caspase 3/9活性。
体内移植瘤实验
验证RNF112在体内对CRC肿瘤生长的影响。
将稳定过表达或敲低RNF112的SW620或DLD1细胞皮下注射入裸鼠，监测肿瘤体积，并通过免疫组化和TUNEL染色评估增殖和凋亡。
KLF4调控RNF112转录的机制研究
证实KLF4作为转录因子调控RNF112表达。
通过生物信息学预测和实验验证，包括荧光素酶报告基因和Ch-IP实验，检测KLF4对RNF112启动子的结合和转录调控。
RNF112与NAA40的相互作用及泛素化降解机制
揭示RNF112促进NAA40泛素化降解的分子机制。
通过Co-IP、免疫荧光、泛素化实验，在SW620和HEK293T细胞中检测RNF112与NAA40的结合及泛素化水平，并使用RNF112-Mut验证其E3连接酶活性。
回补实验
验证NAA40在RNF112功能中的必要性。
在SW620细胞中共转染RNF112和NAA40过表达质粒，检测细胞活力、细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Solarbio | -- |
| L-15培养基 | Procell | -- | |
| 转染 | 脂质体3000 | Invitrogen | -- |
| 细胞活力检测 | CCK8试剂 | KeyGEN | -- |
| 细胞周期检测 | 碘化丙啶/RNase A | KeyGEN | -- |
| 凋亡检测 | 膜联蛋白V-FITC | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| Caspase活性检测 | Caspase-3活性检测试剂盒 | Beyotime | C1116 |
| Caspase-9活性检测试剂盒 | Beyotime | C1158 | |
| TUNEL染色 | 曲拉通X-100 | Beyotime | -- |
| Western blot | RNF112抗体 | Thermo Fisher | PA5-118,985 |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | Affinity | AF0198 |
| Western blot | 细胞周期蛋白E1抗体 | Proteintech | 11,554–1-AP |
| 细胞周期蛋白D1抗体 | Proteintech | 26,939–1-AP | |
| NAA40抗体 | Proteintech | 16,698–1-AP | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Beyotime | A0208 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Beyotime | A0216 | |
| 蛋白提取 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Abcam | -- |
| ECL化学发光试剂 | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIpure试剂 | -- | -- |
| 逆转录 | All-in-One第一链合成预混液 | Magen | -- |
| RT-qPCR | SYBR Green试剂盒 | Solarbio | -- |
| 免疫荧光 | Flag抗体 | Proteintech | 66,008–4-Ig |
| 二抗 | CST | 4408 | |
| 二抗 | CST | 4413 | |
| Ch-IP | KLF4抗体 | Proteintech | 11,880–1-AP |
| 蛋白A+G琼脂糖/鲑鱼精DNA | -- | -- | |
| 药物处理 | MG132 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养基条件：DLD1、GP2D、NCM460用1640培养基，SW1116和SW620用L-15培养基；均于37°C、5% CO2培养。 阅读提示：Materials and methods - Cell culture |
| RNF112敲低和过表达 | siRNA序列（5条）和shRNA序列（2条）；过表达质粒构建（KLF4 CDS、RNF112 CDS、NAA40 CDS克隆至pcDNA3.1）；转染试剂Liposome 3000。 阅读提示：Materials and methods - Knockdown and overexpression |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度5×10^3/孔；CCK8试剂；OD450读数；检测时间点48h和72h。 阅读提示：Materials and methods - Cell viability analysis |
| 细胞周期和凋亡检测 | 流式细胞术；细胞周期用PI/RNase A处理30分钟；凋亡用AnnexinV-FITC和PI处理10分钟；使用NovoCyte流式细胞仪。 阅读提示：Materials and methods - Flow cytometry detection |
| 体内成瘤实验 | BALB/c裸鼠（4周龄）；分组：vector、RNF112 OE、NC、RNF112 shRNA-1、shRNA-2；皮下注射2×10^6个细胞；每5天测量肿瘤大小；4周后处死。 阅读提示：Materials and methods - Xenotransplantation |
| KLF4转录调控 | 荧光素酶报告基因实验：RNF112启动子片段（-1801~+15和-2000~+15）克隆至报告载体；KLF4过表达质粒共转染；Ch-IP使用KLF4抗体，PCR引物。 阅读提示：Materials and methods - Luciferase reporter assay, Chromatin-immunoprecipitation (Ch-IP) assay |
| 泛素化实验 | MG132浓度10 μM处理8小时；CHX浓度100 μg/ml处理0,2,4,6,8小时；转染质粒RNF112-Flag、NAA40-His、Ub-HA；HEK293T细胞。 阅读提示：Materials and methods - Ubiquitination assay, Co-immunoprecipitation (Co-IP) |