尿液 eccDNA 的分离与测序
表征 PCa 和 NC 个体尿液细胞游离 eccDNA 的基因组图谱。
收集 21 例 PCa 患者和 16 例 NC 个体中段尿液，提取 cfDNA，用 Plasmid-Safe DNase 去除线性 DNA，经 MDA 扩增、片段化、建库后进行 Illumina NovaSeq 6000 双端 150 bp 测序。
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前列腺癌中尿液 eccDNA 图谱揭示其与基因组不稳定性的关联及在癌症进展中的重要作用
The urinary eccDNA landscape in prostate cancer reveals associations with genome instability and vital roles in cancer progression.
实验完整度
高包含患者样本 Circle-seq、细胞系药物处理、体外合成 eccDNA 转染功能验证及 RNA-seq 机制分析，涉及多层级证据。
主要模型
PCa 患者尿液样本 NC 个体尿液样本 PC-3 前列腺癌细胞系 HEK293T 细胞系
重点核对
PCa 患者（n=21）与 NC 个体（n=16）尿液样本的 Circle-seq PC-3 细胞药物处理：CDDP 1 μM、ETO 30 μM、ISO 20 μM、多西他赛 15 nM，处理 48h 或 72h 体外合成 TXLNA 外显子来源 eccDNA 和基因间 eccDNA 转染 PC-3 细胞（500 ng） 差异表达基因筛选阈值：P < 0.05 且 fold change ≥ 1.5 或 ≤ 0.67
摘要
引言：染色体外环状 DNA（eccDNA）在癌症进展和预后中发挥重要作用。然而，细胞游离 eccDNA 被认为比线性 DNA 更稳定，其是否具有癌症特异性的基因组特征仍不清楚。此外，eccDNA 的生物发生和功能尚未完全了解。目的：本研究旨在表征前列腺癌（PCa）和非癌症（NC）个体中尿液细胞游离 eccDNA 的基因组图谱，阐明其生物发生和 PCa 特异性基因组特征，并研究它们在 PCa 进展中的作用。方法：我们对 21 名 PCa 患者和 16 名 NC 个体进行了尿液 Circle-seq，与其他组学数据集进行了整合分析，最后通过体外转染和 RNA-seq 验证了 eccDNA 的功能。结果：我们率先描绘了 PCa 中尿液细胞游离 eccDNA 图谱，并揭示了 eccDNA 生成与活跃染色质状态及基因转录之间的高度关联。优先发生在活跃基因组位点并导致基因组不稳定性的双链断裂和 R 环可以促进 eccDNA 的生成。基因组不稳定性常导致基因组突变，我们的研究进一步建立了 eccDNA 生成与致癌突变之间的联系。此外，在 PCa 中特异性表现出高 eccDNA 生成频率的基因（HFGs）促进了 PCa 的进展，并与 PCa 患者较差的生存结果相关。最后，我们证明了源自 PCa 特异性 HFG 的 eccDNA，与基因间 eccDNA 相反，可以抑制 PCa 细胞的增殖和迁移，且这种作用独立于其宿主基因的表达。结论：我们的研究阐明了活性基因中双链断裂产生 eccDNA 的生物发生机制，揭示了 PCa 特异性 eccDNA 特征，并提出了 eccDNA 功能的新机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 尿液细胞游离 eccDNA 是否具有前列腺癌特异性基因组特征，其生物发生机制及在 PCa 进展中的作用是什么？
- 核心机制
- 双链断裂和 R 环促进了 eccDNA 的生成；PCa 特异性高频生成基因（HFGs）与致癌突变相关，其来源的 eccDNA 通过转录的 RNA 调控宿主基因相关通路，抑制 PCa 细胞增殖和迁移，且不依赖宿主基因表达。
- 主要证据
- 对 21 例 PCa 和 16 例 NC 尿液样本进行 Circle-seq，发现 eccDNA 富集于活性染色质区域，并与 DSB 和 R 环相关；药物处理（CDDP、ETO、ISO）诱导 DSB 或 R 环后 eccDNA 水平升高；转染 TXLNA 外显子来源 eccDNA 显著抑制 PC-3 细胞增殖和迁移；RNA-seq 显示 TXLNA eccDNA 特异性调控 163 个 DEGs，富集于分泌通路和囊泡融合。
- 研究意义
- 尿液 eccDNA 有望作为前列腺癌诊断的非侵入性生物标志物，并可能通过工程化 eccDNA 转录功能性小 RNA 为靶向 RNA 治疗提供新途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
eccDNA 生物发生机制分析
探究活性染色质、DSB 和 R 环对 eccDNA 生成的影响。
整合公共 Hi-C、ATAC-seq、ChIP-seq 数据评估 eccDNA 在 A/B 区室和组蛋白修饰区域的富集；整合公共 DSB 数据（sBLISS、DSBCapture、BLESS）计算与 eccDNA 的相关性；对 PC-3 细胞进行 CUT&Tag 分析 R 环；用 CDDP、ETO、ISO 和多西他赛处理 PC-3 细胞，通过 qPCR 检测 eccDNA 丰度变化。
PCa 特异性高频生成基因（HFGs）鉴定及与突变关联
识别 PCa 特异性 HFGs 并探讨其与致癌突变和 PCa 进展的关系。
定义 HFGs 为 eccDNA 生成频率>50%（PCa≥10 样本，NC≥8 样本），筛选 PCa 特异性 HFGs，并整合 TCGA-PRAD 突变和生存数据进行分析。
体外合成 eccDNA 转染功能验证
验证 PCa 特异性 HFG 来源的 eccDNA 对 PCa 细胞增殖和迁移的影响。
合成 TXLNA 外显子来源的三个 eccDNA 和一个基因间 eccDNA，转染 PC-3 细胞，通过 CCK-8 实验、划痕愈合实验、Transwell 迁移实验评估细胞增殖和迁移能力，并通过 RNA-seq 分析差异表达基因。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 尿液 eccDNA 提取 | Quick-DNA™ 尿液 DNA 试剂盒 | ZYMO RESEARCH | D3061 |
| 线性 DNA 去除 | Plasmid-Safe 脱氧核糖核酸酶 | Epicentre | E3110K |
| DNA 纯化 | DNA 磁珠纯化 | Vazyme | N411 |
| eccDNA 扩增 | Phi29 MAX DNA 聚合酶 | Vazyme | N106 |
| 抗外切酶随机引物 | MCLAB | ERRP-110 | |
| dNTP 混合液 | NEB | N0447S | |
| eccDNA 去分枝 | S1 核酸酶 | Thermo | EN0321 |
| 文库构建 | VAHTS 通用 DNA 文库制备试剂盒（Illumina V3） | Vazyme | ND607 |
| 文库质控 | Agilent DNF-915 试剂盒 | Agilent | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | -- |
| eccDNA 验证 | 3G Taq 预混液（PAGE，红色染料） | Vazyme | P115 |
| eccDNA 定量 | 质粒小提 AX 试剂盒 | A&A Biotechnology | 010-50 |
| ChIP DNA 清洁与浓缩试剂盒 | ZYMO RESEARCH | D5205 | |
| qPCR | Taq Pro 通用 SYBR qPCR 预混液 | Vazyme | Q712 |
| 细胞培养 | DMEM 培养基 | Servicebio | G4511-500ML |
| Ham's F-12K 培养基 | Servicebio | G4560-500ML | |
| 胎牛血清 | Procell | 164210-500 | |
| 青霉素/链霉素 | Servicebio | G4003-100ML | |
| 支原体检测 | MycoBlue 支原体检测试剂盒 | Vazyme | D101-01 |
| 药物处理 | 顺铂 | -- | -- |
| 乙硫异烟胺 | -- | -- | |
| 异银杏双黄酮 | -- | -- | |
| 多西他赛 | -- | -- | |
| R 环图谱 | Hyperactive 通用 CUT&Tag 检测试剂盒（Illumina） | Vazyme | TD903 |
| 抗 DNA-RNA 杂交抗体（克隆 S9.6） | Millipore | MABE1095 | |
| 体外 eccDNA 合成 | T4 DNA 连接酶 | Vazyme | C301 |
| 体外转染 | 线性聚乙烯亚胺（PEI）MW40000 | Yeasen | 40816ES02 |
| RNA/DNA 共提取 | DNA/RNA 提取试剂盒 | TIANGEN | DP422 |
| 细胞增殖检测 | CCK-8 试剂盒 | GLPBIO | GK10001 |
| 细胞迁移检测 | Transwell® 8.0 µm 孔径聚碳酸酯膜嵌入 | Corning | 3422 |
| Western blot | RIPA 裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013B |
| 硝酸纤维素膜 | Beyotime Biotechnology | FFN08 | |
| TXLNA 一抗 | Abclonal | A18291 | |
| β-actin 抗体 | Proteintech | 10068-1-AP | |
| Multi-rAb HRP 山羊抗兔重组二抗 (H+L) | Proteintech | RGAR001 | |
| HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG (H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| Super ECL 检测试剂 | Yeasen | 36208ES60 | |
| Amersham Imager 680 成像仪 | GE Healthcare | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 尿液样本收集 | PCa 患者（21 例）和 NC 个体（16 例）的临床分期、年龄、BMI 阅读提示：Materials and methods: Participant recruitment and urine sample collection |
| Circle-seq | Plasmid-Safe DNase 处理条件（5 U，37°C 16 h）、MDA 扩增时间（30°C 8 h）、DNA 打断片段大小（400 bp） 阅读提示：Materials and methods: Urinary eccDNA purification and Circle-seq |
| 药物处理 | CDDP 1 μM、ETO 30 μM、ISO 20 μM、多西他赛 15 nM；处理时间 48h 或 72h 阅读提示：Materials and methods: Drug treatments |
| R 环 CUT&Tag | ISO 处理浓度（30 μM）和时长（24 h） 阅读提示：Materials and methods: CUT&Tag for R-loop profiling |
| 体外 eccDNA 转染 | 转染量（500 ng）、细胞密度（1.5 × 10^5 每孔）、转染试剂 PEI 阅读提示：Materials and methods: In vitro eccDNA transfection assay |
| 功能实验 | CCK-8 细胞密度（5,000 细胞/孔）、划痕实验细胞密度（6×10^5）、Transwell 细胞密度（2×10^5） 阅读提示：Materials and methods: Cell counting Kit-8 assay, Cell scratch healing assay, Transwell migration assay |
| RNA-seq 分析 | 差异表达基因阈值（P < 0.05 且 fold change ≥ 1.5 或 ≤ 0.67） 阅读提示：Materials and methods: RNA-seq library construction, data processing, and differential analysis |