临床样本分析鉴定FKBP10
鉴定与MIBC相关的差异表达蛋白。
分析来自145例膀胱癌组织的蛋白质组数据，比较MIBC与NMIBC，筛出9个上调蛋白，其中FKBP10最显著；随后用8对新鲜标本Western blot和100例TMA的IHC验证。
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FKBP10通过Lamin A失调促进膀胱癌的肌层浸润
FKBP10 Promotes the Muscle Invasion of Bladder Cancer via Lamin A Dysregulation.
实验完整度
高包含患者样本分析、细胞功能实验、体内动物模型（原位、异种移植、肺转移）、分子机制验证（Co-IP、pull-down、质谱）及回复实验。
主要模型
膀胱癌细胞系UMUC3和T24 原位膀胱肿瘤模型（裸鼠） 皮下异种移植模型（裸鼠） 肺转移模型（裸鼠） 膀胱癌患者组织样本
重点核对
FKBP10敲低或过表达稳定细胞系的构建（shRNA或过表达质粒） 细胞迁移和侵袭的Transwell实验（不同孔径3、5、8μm） 原位膀胱肿瘤模型中，肿瘤细胞注入膀胱壁的细节（1×10^6细胞，50μl PBS） FKBP10与前体lamin A相互作用的Co-IP和pull-down实验条件 细胞核质分离实验及lonafarnib处理条件（5μM，48小时）
摘要
膀胱癌（BC）是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，肌层浸润性膀胱癌（MIBC）尤其具有侵袭性并与不良预后相关。MIBC的特征之一是核异型性。然而，MIBC的分子机制仍不清楚。在此，我们发现FKBP10在MIBC组织中显著上调，并与转移和不良预后相关。FKBP10促进肿瘤细胞侵袭、迁移和转移，但不影响增殖。值得注意的是，FKBP10增强了BC细胞的核异型性。机制上，FKBP10与前体lamin A相互作用，阻碍前体lamin A进入细胞核，从而导致核内lamin A减少，而lamin A是参与核异型性的关键因子。在人BC组织中，核内lamin A下调，并与FKBP10表达呈负相关。总之，我们的研究结果表明FKBP10/前体lamin A/lamin A轴促进了MIBC的发生发展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 膀胱癌中肌层浸润和核异型性背后的分子机制尚不清楚，本研究旨在探究FKBP10在其中的作用。
- 核心机制
- FKBP10与prelamin A直接结合，将prelamin A滞留在内质网，减少其进入细胞核，导致核内lamin A水平降低，进而促进核异型性、细胞侵袭和迁移。
- 主要证据
- 临床样本蛋白质组和免疫组化显示FKBP10在MIBC中高表达且与不良预后相关；体外实验显示FKBP10促进迁移和侵袭；原位模型中敲低FKBP10减少肌肉浸润；Co-IP和pull-down证实直接结合；核质分离和免疫荧光显示FKBP10改变prelamin A的分布；LMNA敲低回复实验证实lamin A是关键介质。
- 研究意义
- 本研究揭示了FKBP10/prelamin A/lamin A轴在调控膀胱癌核异型性和肌层浸润中的重要作用，并指出FKBP10是膀胱癌潜在的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞功能实验
验证FKBP10对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
构建FKBP10敲低和过表达稳定细胞系，进行CCK8、划痕愈合和Transwell实验，并检测核圆度。
体内动物实验
验证FKBP10在体内对肿瘤生长、肌肉浸润和转移的影响。
利用皮下异种移植、原位膀胱肿瘤、竞争性生长和肺转移模型，评估FKBP10敲低对肿瘤重量、肌肉浸润和肺转移的影响。
互作蛋白筛选与验证
鉴定FKBP10的相互作用蛋白并验证直接结合。
通过免疫沉淀质谱筛选，Co-IP验证内源和外源相互作用，pull-down验证直接结合，免疫荧光观察共定位，分子对接预测结合域，截短体Co-IP确定结构域。
机制验证：FKBP10对prelamin A入核的影响
验证FKBP10是否将prelamin A滞留在细胞质，从而减少核内lamin A。
通过Western blot检测总蛋白和核质分离，免疫荧光检测prelamin A定位，并用FKBP10截短体恢复实验证明其结构域依赖性。
回复实验
证明lamin A介导FKBP10对核异型和迁移侵袭的影响。
在FKBP10敲低细胞中同时转染LMNA siRNA，检测核圆度和迁移侵袭能力。
临床相关性验证
验证FKBP10与lamin A表达在人类膀胱癌中的负相关。
分析蛋白质组数据和另外100例样本的IHC评分，进行相关性分析和分期比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Procell | -- |
| RPMI 1640培养基 | Procell | -- | |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 聚凝胺 | Solarbio | -- | |
| 嘌呤霉素 | Solarbio | -- | |
| 转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| 细胞核质分离 | 核质提取试剂盒 | Abbkine | KTP3001 |
| 药物处理 | 洛那法尼 | MCE | HY-15136 |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | -- |
| FKBP10抗体 | Proteintech | 12172-1-AP | |
| 前体lamin A抗体 | Merck | MABT858 | |
| lamin A/C抗体 | Proteintech | 10298-1-AP | |
| Histone H3抗体 | Proteintech | 17168-1-AP | |
| Flag抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig | |
| HA抗体 | Proteintech | 81290-1-RR | |
| 6*His抗体 | Proteintech | 66005-1-Ig | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 81640-5-RR | |
| 免疫组化 | FKBP10抗体（免疫组化） | Proteintech | 12172-1-AP |
| lamin A/C抗体（免疫组化） | Proteintech | 10298-1-AP | |
| DAB显色底物 | Maixin Biotech | -- | |
| 免疫荧光 | GFP抗体 | CST | ab213511 |
| mCherry抗体 | Abcam | ab213511 | |
| FKBP10抗体（免疫荧光） | Proteintech | 12172-1-AP | |
| 前体lamin A抗体（免疫荧光） | Merck | MABT858 | |
| DAPI染色液 | Abcam | ab104139 | |
| 488标记山羊抗小鼠IgG | ABclonal | -- | |
| 594标记山羊抗兔IgG | ABclonal | -- | |
| CCK8实验 | CCK8试剂 | Abbkine | KTA1020 |
| 免疫沉淀 | NP-40裂解液 | Solarbio | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Selleck | B14001 | |
| FKBP10抗体（免疫沉淀） | Proteintech | 12172-1-AP | |
| 阴性对照IgG | MCE | HY-P73904 | |
| Protein A/G磁珠 | MCE | HY-K0202 | |
| 质谱分析 | Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Co-IP | Anti-Flag磁珠 | Selleck | B26101 |
| Anti-HA磁珠 | MCE | HY-K0201 | |
| 动物实验 | 裸鼠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系UMUC3和T24的来源、培养基（DMEM/RPMI 1640）、FBS浓度（10%）、培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Methods: Cell cultures |
| 稳定细胞系构建 | shRNA靶序列、慢病毒包装、感染时polybrene浓度（2μg/ml）、筛选时puromycin浓度（2μg/ml）和时间（72小时） 阅读提示：Methods: Lentiviral-infected stable cell lines; Supplementary Table 1 |
| 瞬时转染 | 质粒构建（FKBP10-Flag，prelamin A-HA）、jetPRIME用量（2:1比例）、细胞密度（70%） 阅读提示：Methods: Plasmids and transient transfection |
| Western blot | 抗体稀释度、上样量（20μg）、封闭条件（5%脱脂奶粉）、细胞核质分离试剂盒及lonafarnib处理条件（5μM，48小时） 阅读提示：Methods: Western blot analysis |
| 免疫组化与免疫荧光 | 一抗稀释度、抗原修复条件（柠檬酸缓冲液）、DAB显色、荧光染料（TSA）和洗涤条件 阅读提示：Methods: Immunohistochemistry (IHC); Immunofluorescence (IF) |
| 体外功能实验 | 划痕愈合的时间和图像分析（ImageJ）、Transwell细胞数（1×10^4）和孔径（3/5/8μm）、CCK8细胞数（1×10^3）和时间点（0/24/48/72h） 阅读提示：Methods: Wound healing assay; Transwell assay; CCK8 assay |
| 体内动物模型 | 小鼠品系（6周龄雄性裸鼠）、细胞注射数（1×10^6）、注射体积（原位50μl，尾静脉100μl）、实验时间（原位3周，皮下4周，肺转移8周） 阅读提示：Methods: Animal experiments; Figure legends 3A-3H |
| 分子互作验证 | 免疫沉淀抗体、磁珠类型、洗涤缓冲液（PBST）、质谱参数、Co-IP和pull-down的孵育时间（4°C过夜） 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation (IP) and Mass Spectrometry (MS) analysis; Co-Immunoprecipitation (Co-IP); Pull-down assay |