患者变异建模
模拟患者MCM10变异以研究其功能影响
利用rAAV和CRISPR-Cas9在HCT116和RPE-1细胞中引入MCM10移码和剪接变异，生成杂合细胞系，并通过Western blot验证蛋白水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
双等位MCM10变异与免疫功能障碍及心肌病相关并导致端粒缩短
Bi-allelic MCM10 variants associated with immune dysfunction and cardiomyopathy cause telomere shortening
实验完整度
高包含细胞模型（HCT116/RPE-1）的体外实验、基因编辑、蛋白质生化分析、端粒功能检测及MUS81双突变验证，多层次功能与机制验证。
主要模型
HCT116细胞系 hTERT RPE-1细胞系 MCM10+/- HCT116细胞系 MCM10+/- RPE-1细胞系
重点核对
MCM10+/−细胞中MCM10蛋白水平降低（Western blot） 细胞增殖速率和克隆形成存活率（细胞计数和克隆形成实验） 细胞周期分布和DNA合成（EdU和DAPI流式分析） 复制叉速度和起始距离（DNA combing） 端粒长度和端粒酶活性（TRF和TRAP）
摘要
微小染色体维持蛋白10（MCM10）对真核DNA复制至关重要。在此，我们描述了复合杂合MCM10变异患者的表现，其临床表型独特但重叠：自然杀伤（NK）细胞缺陷（NKD）和伴有脾脏及胸腺发育不全的限制性心肌病（RCM）。为了理解MCM10相关疾病的机制，我们在人类细胞系中模拟了这些变异。MCM10缺陷导致慢性复制应激，通过增加基因组不稳定性和端粒侵蚀而降低细胞活力。我们的数据表明，MCM10功能丧失通过积累富含单链DNA的异常复制叉结构来限制端粒酶活性。MCM10缺陷细胞中末端停滞的复制叉需要MUS81进行核酸内切酶加工，因为MCM10：MUS81双突变体显示活力降低和端粒缩短加速。我们提出，MCM10中的这些双等位变异使特定心脏和免疫细胞谱系在分化过程中过早停滞，导致NKD和RCM患者观察到的临床表型。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MCM10双等位变异如何导致NK细胞缺陷和限制性心肌病？
- 核心机制
- MCM10功能丧失导致复制应激和端粒复制叉停滞，积累含单链DNA的异常结构，限制端粒酶活性，加速端粒缩短，最终导致细胞谱系分化障碍。
- 主要证据
- 在HCT116和RPE-1细胞中敲低MCM10导致细胞增殖降低、复制叉减少、端粒缩短；MUS81缺失加剧表型；端粒酶过表达可恢复端粒长度但不缓解复制缺陷。
- 研究意义
- 揭示了MCM10在端粒复制中的关键作用，为MCM10相关NKD和RCM的病理机制提供了见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
复制功能分析
评估MCM10缺陷对DNA复制的影响
通过流式细胞术分析细胞周期和EdU掺入，DNA combing测量复制叉速度和起点距离，PCNA泛素化检测活性复制叉。
基因组稳定性分析
检查MCM10缺陷导致的基因组不稳定性和端粒缺陷
通过核型分析、TRF分析、t-FISH和β-半乳糖苷酶活性检测端粒长度和细胞衰老。
端粒复制分析
研究端粒复制叉停滞和端粒酶的作用
在过表达端粒酶的ST细胞系中，通过DNA combing和2D凝胶电泳分析端粒复制中间体，并用S1核酸酶处理确认ssDNA。
MUS81功能验证
测试MUS81在MCM10缺陷细胞中的补偿作用
生成MUS81-/-和MCM10+/-:MUS81-/-双突变细胞系，分析增殖、凋亡、端粒长度和β-gal活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | Corning | 10-050-CV |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | 11320 | |
| 胎牛血清 | Sigma | F4135 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 205030 | |
| 蛋白纯化 | HisPur Ni-NTA树脂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| HiLoad 26/600 Superdex 75柱 | GE Healthcare | -- | |
| 分析性尺寸排阻色谱 | Superdex 75 Increase 10/300 GL柱 | GE Healthcare | -- |
| 圆二色谱 | Jasco J-815 CD分光偏振计 | Jasco | -- |
| 石英比色皿 | Starna Ltd. | -- | |
| 细胞培养 | G418 | Sigma | G5005 |
| 表达Cre的腺病毒 | Vector Biolabs | #1045 | |
| Lipofectamine LTX转染试剂 | Invitrogen | 15338030 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000 | |
| Cas9 mRNA | TriLink | L-7206 | |
| Neon转染系统 | Invitrogen | MPK5000 | |
| 嘌呤霉素 | Sigma | P7255 | |
| 细胞增殖 | 台盼蓝 | Invitrogen | T10282 |
| Countess计数板 | Invitrogen | C10283 | |
| Countess自动细胞计数仪 | Invitrogen | C20181 | |
| Western blot | MCM10抗体 | Bethyl | A300-131A |
| MCM10抗体 | Novus | H00055388-D01P | |
| CDC45抗体 | Santa Cruz | SC55568 | |
| MCM4抗体 | Santa Cruz | SC28317 | |
| MUS81抗体 | Abcam | ab14387 | |
| PCNA抗体 | Abcam | Ab29 | |
| 抗泛素化PCNA (Lys164)抗体 | Cell Signaling Technology | mAb13439 | |
| RPA32抗体 | Bethyl | A300-245A | |
| GAPDH抗体 | GeneTex | GTX627408 | |
| α-微管蛋白抗体 | Millipore | T9026 | |
| Lamin B1抗体 | Proteintech | #12987 | |
| 山羊抗小鼠HRP二抗 | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| 山羊抗兔HRP二抗 | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| 山羊抗小鼠HRP二抗 | BioRad | 1706516 | |
| 驴抗兔HRP二抗 | Amersham | NA9340 | |
| WesternBright Quantum检测试剂盒 | K-12042-D20 | -- | |
| 流式细胞术 | EdU (5-乙炔基-2'-脱氧尿苷) | Santa Cruz | sc-284628 |
| AF647-叠氮化物 | Life Technologies | A10277 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| 核糖核酸酶A | Sigma | R6513 | |
| MCM2抗体 | BD Biosciences | #610700 | |
| 驴抗小鼠AF488二抗 | Jackson Immunoresearch | 715-545-150 | |
| APC Annexin V凋亡检测试剂盒 | Biolegend | 640932 | |
| Attune NxT流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| LSR II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FACSCanto A V0730042流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| DNA combing | IdU (5-碘-2'-脱氧尿苷) | Sigma | C6891 |
| CldU (5-氯-2'-脱氧尿苷) | Sigma | I7125 | |
| NuSieve GTG琼脂糖 | Lonza | 50080 | |
| 蛋白酶K | 2 mg/ml | -- | |
| MES | Calbiochem | #475893 | |
| β-琼脂糖酶 | NEB | M0392 | |
| 盖玻片（Genomic Vision） | Genomic Vision | COV-001 | |
| YOYO-1 | Invitrogen | Y3601 | |
| 单链DNA抗体 | IBL | 18731 | |
| BrdU/IdU抗体 | BD Biosciences | 347580 | |
| BrdU/CldU抗体 | Abcam | ab6326 | |
| 山羊抗小鼠Cy3.5二抗 | Abcam | ab6946 | |
| 山羊抗大鼠Cy5二抗 | Abcam | ab6565 | |
| 山羊抗兔BV480二抗 | BD Horizon | #564879 | |
| TelG-Alexa488标记的PNA探针 | PNA Bio | F1008 | |
| RsaI限制性内切酶 | NEB | R0167 | |
| HinfI限制性内切酶 | NEB | R0155 | |
| Roche封闭试剂 | Roche | 11096176001 | |
| EVOS FL成像系统 | ThermoFisher | AMF43000 | |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | -- | -- |
| 细胞衰老检测 | 96孔细胞衰老检测试剂盒 | Cell Biolabs | CBA-231 |
| 蛋白测定染料 | BioRad | #500-0006 | |
| VICTOR3V 1420多功能酶标仪 | Perkin Elmer | -- | |
| TRF分析 | Gentra Puregene细胞提取试剂盒 | Qiagen | 158745 |
| Hybond-XL膜 | GE Healthcare | RPN303S | |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | M0201 | |
| γ-P32-ATP | Perkin Elmer | NEG035C | |
| 快速离心柱 | Roche | 11-273-949-001 | |
| Typhoon FLA 9500成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| 端粒酶抑制剂BIBR1532 | Tocris | #2981 | |
| 2D凝胶分析 | S1核酸酶 | Thermo Scientific | #EN0321 |
| TRAP分析 | TRAPeze端粒酶检测试剂盒 | EMD-Millipore | S7700 |
| Platinum Taq DNA聚合酶 | Invitrogen | 10966 | |
| SYBR GOLD核酸染料 | Invitrogen | S11494 | |
| t-FISH | KaryoMAX秋水仙胺 | Gibco | 15212-012 |
| TelC-Cy3 PNA探针 | PNA Bio | F1002 | |
| CENPB-Alexa488 PNA探针 | PNA Bio | F3004 | |
| TSA封闭试剂 | Perkin Elmer | FP1012 | |
| t-SCE分析 | BrdU | MP Biomedicals | 100166 |
| BrdC | Sigma | B5002 | |
| TelC-Alexa488 PNA探针 | PNA Bio | F1004 | |
| TelG-Cy3 PNA探针 | PNA Bio | F1006 | |
| 测序 | SeqCap EZ人类外显子组文库v2.0 | NimbleGen | -- |
| HiSeq2500测序仪 | Illumina | -- | |
| BigDye Terminator 3.1试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| Agencourt CleanSEQ系统 | Beckman Coulter | -- | |
| ABI Prism 3730遗传分析仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞培养 | pBABEpuroUThTERT+U3-hTR-500质粒 | Addgene | #27665 |
| PX458质粒 | Addgene | #48138 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（HCT116和RPE-1）、培养基、血清浓度、培养条件 阅读提示：Methods: Cell lines |
| 基因编辑 | rAAV和CRISPR-Cas9靶向外显子、gRNA序列、转染方法、筛选标记 阅读提示：Methods: Cell line generation |
| 复制分析 | EdU浓度、标记时间、DAPI染色、流式细胞仪设置、DNA combing标记方案 阅读提示：Methods: FACS analysis, DNA combing |
| 端粒分析 | TRF分析中限制性酶、探针、杂交条件；t-FISH的探针和变性条件；TRAP分析的细胞裂解和PCR条件 阅读提示：Methods: Telomere restriction fragment (TRF) analysis, Immunofluorescence analyses of telomeres, Telomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay |
| MUS81功能验证 | MUS81敲除的gRNA、转染条件、MCM10和MUS81的蛋白水平验证、增殖和凋亡检测条件 阅读提示：Methods: Cell line generation, Western blot, Cell proliferation, FACS analysis |