负载铜的水凝胶局部递送普萘洛尔通过肾上腺素能β受体阻断促进感染性烧伤创面愈合

Localized propranolol delivery from a copper-loaded hydrogel for enhancing infected burn wound healing via adrenergic β-receptor blockade.

作者信息Wenzhe Sun, Hongwei Lu, Pengqin Zhang, Lian Zeng, Bing Ye, Yi Xu, Jianan Chen, Peiran Xue, Jialin Yu, Kaifang Chen, Bin Wu, Xiao Lv, Xiaodong Guo, Yanzhen Qu
PMID39896979
发布时间2024-12-30
DOI10.1016/j.mtbio.2024.101417

实验完整度

包含体外细胞实验(HUVECs、PC12)、细菌实验、动物模型(SD大鼠三度烧伤)等多层级验证,并涵盖功能与机制验证。

主要模型

HUVECs细胞模型 PC12细胞模型(模拟交感神经元) SD大鼠三度全层烧伤感染模型 铜交联明胶/海藻酸盐水凝胶(PNL@GA-Cu)

重点核对

水凝胶组成:明胶(NeoFroxx, 1042GR100)、海藻酸钠(Solarbio, A9640)、盐酸普萘洛尔(Aladdin, 318-98-9)、CuSO4(Aladdin, 7758-98-7) 交联条件:1.5% (w/v) CuSO4溶液,交联时间5分钟 细菌实验:大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,菌液浓度10^8 CFU/mL,共培养6小时 动物模型:SD大鼠,体重180-200g,100°C铜块作用15秒造成三度烧伤,接种金黄色葡萄球菌 给药方式:水凝胶局部应用于创面,覆盖Tegaderm™薄膜敷料

摘要

严重烧伤会立即触发持续的全身和局部应激反应。在此过程中,交感神经系统释放大量儿茶酚胺,与细胞膜上的β-肾上腺素能受体(β-AR)结合,对皮肤再生产生不利影响。此外,反复的细菌感染使烧伤创面难以治疗,对烧伤护理构成重大且持续的挑战。为了应对这些挑战,我们率先研究了局部递送普萘洛尔治疗烧伤创面的方法,揭示了其拮抗去甲肾上腺素(NE)和调节交感神经系统的能力。本研究开发了一种负载Cu2⁺的抗交感神经水凝胶(铜离子交联的普萘洛尔@明胶/海藻酸盐,PNL@GA-Cu),以重塑具有挑战性的神经调节微环境并加速感染性烧伤创面的修复。该水凝胶系统在降解过程中同时释放Cu2⁺和普萘洛尔,协同作用于局部创面组织。Cu2⁺具有抗菌和促进血管生成的双重作用,能有效杀灭金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,同时增强血管生成相关基因(CD31、VEGF)的表达。同时,普萘洛尔可以抵消NE模拟的慢性应激微环境对血管生成的抑制作用,并减轻伤口愈合早期的交感神经支配。最后,PNL@GA-Cu水凝胶显著促进了SD大鼠三度全层烧伤的修复。针对烧伤创面治疗的神经微环境方法在文献中尚未见报道。抗交感神经的PNL@GA-Cu水凝胶为治疗感染性烧伤创面提供了一种有前景的策略。重塑神经调节微环境可能成为组织工程中的一种新兴策略。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
开发一种能够局部递送普萘洛尔并通过β-肾上腺素能受体阻断来促进感染性烧伤创面愈合的水凝胶系统。
核心机制
PNL@GA-Cu水凝胶通过释放Cu2+发挥抗菌和促进血管生成的作用,同时释放普萘洛尔阻断β受体,拮抗去甲肾上腺素对血管生成的抑制作用,并减轻交感神经支配,从而促进烧伤创面修复。
主要证据
体外实验显示水凝胶释放的Cu2+有效杀灭大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,促进HUVEC迁移和血管形成;普萘洛尔逆转了NE对血管生成的抑制。体内实验显示PNL@GA-Cu水凝胶处理7天后创面闭合率达81.13±3.79%,14天达95.30±3.34%,显著高于其他组。
研究意义
该研究首次提出针对烧伤创面治疗的神经微环境方法,抗交感神经水凝胶为治疗感染性烧伤创面提供了有前景的策略,重塑神经调节微环境可能成为组织工程中的新兴策略。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

水凝胶制备与表征

制备PNL@GA-Cu水凝胶并验证其物理化学性质,包括微观结构、流变学、溶胀、降解和药物释放特性。

将明胶和藻酸钠溶解,加入普萘洛尔,用CuSO4交联。通过SEM观察微观结构,流变仪测量弹性模量,记录溶胀和降解曲线,通过UV-Vis和ICP测量药物释放。

2

体外抗菌活性检测

评估水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌能力。

将细菌悬液与水凝胶共培养后,通过平板计数、活/死染色和SEM观察评估抗菌效果。

3

生物相容性评估

评估水凝胶对HUVECs和PC12细胞的细胞毒性及血液相容性。

通过Live/Dead染色、CCK-8检测、鬼笔环肽染色和溶血实验评估。

4

体外神经活性调节实验

验证水凝胶释放的普萘洛尔对交感神经细胞迁移和活性的影响。

使用PC12细胞进行划痕实验、Transwell迁移实验、TH表达检测(免疫荧光和ELISA),以及FITC-NE结合实验。

5

体外促血管生成实验

验证水凝胶对HUVECs迁移、血管形成和血管生成相关蛋白表达的影响。

划痕实验、Transwell实验、管状形成实验、Western blot检测CD31和VEGF表达、免疫荧光检测CD31。

6

动物体内实验

评估PNL@GA-Cu水凝胶对SD大鼠感染性三度烧伤创面愈合的促进作用。

建立SD大鼠背部三度烧伤模型,接种金黄色葡萄球菌,局部应用水凝胶,观察创面愈合率、组织学染色、免疫荧光检测血管生成和交感神经支配。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
明胶NeoFroxx1042GR100
海藻酸钠SolarbioA9640
盐酸普萘洛尔Aladdin318-98-9
硫酸铜Aladdin7758-98-7
氯化钙Aladdin10043-52-4
磷酸盐缓冲液BiosharpBL302A
DMEM F-12培养基Gibco21331020
人脐静脉内皮细胞ProcellCL-0675
PC12细胞Stem RecellSTM-CL-7012
活/死细胞检测试剂盒SolarbioCA1630
CCK-8检测试剂盒BiosharpBS350A
96孔板Corning--
基质胶Corning356234
BCA蛋白定量试剂盒Beyotime BiotechnologyP0012
PVDF膜BiosharpBS-PVDF-45
脱脂奶粉BiosharpBS102
抗CD31抗体Abcamab76533
抗VEGF抗体Abcamab214424
二抗Abcamab6721
化学发光试剂BiosharpBL523A
Triton X-100Sigma9036-19-5
牛血清白蛋白Sigma10711454001
二抗SigmaC2306, F1262
Hoechst 33342Thermo fisher62249
Dil细胞膜染料Thermo fisherD282
Tegaderm薄膜敷料3M Deutschland GmbH--
抗α-SMA抗体Abcamab7817
抗CD31抗体Abcamab182981
抗TH抗体Abcamab137869
酪氨酸羟化酶ELISA试剂盒Cloud-Clone Corp.SEB438Ra
细菌活/死染色试剂盒Maokang Biotechnology Co., Ltd.--
扫描电子显微镜FEISEM 450
流变仪Malvern--
紫外-可见分光光度计ShimadzuUV-3101PC
电感耦合等离子体发射光谱仪Leeman LabsProdigy-ICP
荧光显微镜OlympusIX73
紫外-可见分光光度计Analytik Jena AGSpecord 210 Plus

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
水凝胶制备
明胶与海藻酸钠的比例、普萘洛尔浓度、交联剂浓度及交联时间
阅读提示:Methods 2.1, 2.2
体外抗菌实验
细菌浓度、共培养时间、水凝胶与细菌体积比
阅读提示:Methods 2.7
细胞实验
细胞类型、培养条件、NE浓度、实验时间点
阅读提示:Methods 2.9, 2.11, 2.12
Western blot
细胞处理时间(5天)、抗体浓度、蛋白定量方法
阅读提示:Methods 2.13
动物实验
动物品系、体重、造模温度与时间、细菌接种、观察时间点
阅读提示:Methods 2.14, Results 3.6
ELISA检测
血浆样本处理步骤、离子刺激条件、检测试剂盒
阅读提示:Methods 2.15