检测circNFIX和SH3RF3在临床样本中的表达
评估circNFIX和SH3RF3在卵巢癌组织中的表达水平及其与临床病理特征的相关性。
收集48例卵巢癌患者的癌组织和癌旁组织，使用qPCR检测circNFIX和SH3RF3的表达，并分析其与肿瘤转移、病理分级和FIGO分期的相关性。
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CircNFIX通过结合LIN28B增强SH3RF3 mRNA稳定性，刺激卵巢癌细胞增殖、侵袭和干性特性
CircNFIX stimulates the proliferation, invasion, and stemness properties of ovarian cancer cells by enhancing SH3RF3 mRNA stability via binding LIN28B.
实验完整度
高包含临床组织样本检测、细胞功能实验（CCK-8、Transwell、成球）、分子机制验证（RIP、Western blot）及拯救实验，多层级验证。
主要模型
卵巢癌细胞系A2780 卵巢癌细胞系SKOV3 正常卵巢上皮细胞HOSEPiCs
重点核对
circNFIX在卵巢癌组织和细胞中的表达水平 sh-circNFIX敲低后对细胞增殖、迁移、侵袭和干性的影响 RIP实验验证LIN28B与circNFIX和SH3RF3的直接结合 circNFIX过表达对SH3RF3表达的影响，以及LIN28B敲低能否逆转 SH3RF3过表达是否逆转circNFIX敲低介导的抗肿瘤效应
摘要
我们旨在研究环状核因子IX（circNFIX）在卵巢癌（OC）癌症生长和干性特性中的调控作用及机制。通过定量实时PCR检测OC组织和细胞中circNFIX和SH3RF3的水平。RNase R处理量化circNFIX RNA稳定性。通过生物信息学软件预测circNFIX、LIN28B和SH3RF3之间的分子相互作用，并通过RNA免疫沉淀（RIP）实验验证。通过细胞计数试剂盒8、Transwell、western blot和成球实验评估circNFIX的获得或缺失实验对体外转移和干性能力的影响。circNFIX和SH3RF3在OC组织和OC细胞中显著升高。敲低circNFIX抑制A2780和SKOV3细胞的增殖、迁移、侵袭和干性特性。RIP实验验证了LIN28B、circNFIX和SH3RF3之间的直接结合关系。此外，circNFIX过表达升高SH3RF3表达，而LIN28B沉默逆转了这种效应。拯救实验表明，SH3RF3的过表达逆转了circNFIX敲低对OC细胞增殖、转移和干性特性的影响。circNFIX通过招募LIN28B改善SH3RF3的mRNA稳定性和翻译，从而在体外促进OC细胞的增殖、侵袭和干性特性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circNFIX在卵巢癌细胞增殖、侵袭和干性特性中的调控作用及分子机制。
- 核心机制
- circNFIX通过结合LIN28B增强SH3RF3 mRNA的稳定性并促进其翻译，从而促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭和干性特性。
- 主要证据
- 临床组织样本中circNFIX和SH3RF3高表达并与肿瘤转移相关；细胞实验中circNFIX敲低抑制细胞增殖、迁移、侵袭和干性，RIP实验验证LIN28B与circNFIX和SH3RF3的结合，功能拯救实验证明SH3RF3过表达逆转circNFIX敲低的效果。
- 研究意义
- 本研究首次阐明circNFIX/LIN28B/SH3RF3轴在卵巢癌中的作用，为卵巢癌治疗提供新的机会，可能延长患者生存期。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证circNFIX和SH3RF3在细胞中的表达及稳定性
确认circNFIX在卵巢癌细胞中的高表达和环状RNA特性。
使用qPCR检测正常卵巢上皮细胞和卵巢癌细胞系中circNFIX和SH3RF3的表达，并通过RNase R处理验证circNFIX的稳定性。
敲低circNFIX的功能实验
评估circNFIX敲低对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和干性特性的影响。
在A2780和SKOV3细胞中转染sh-circNFIX，通过CCK-8、Transwell、western blot和成球实验检测细胞功能变化。
验证circNFIX与LIN28B及SH3RF3的相互作用
验证circNFIX、LIN28B和SH3RF3之间的直接结合关系。
通过RIP实验检测LIN28B抗体沉淀的RNA复合物中circNFIX和SH3RF3的富集；通过亚细胞定位实验检测circNFIX在细胞核和细胞质中的分布。
评估circNFIX对SH3RF3表达的调控及LIN28B的介导作用
验证circNFIX通过LIN28B调控SH3RF3表达的机制。
在A2780和SKOV3细胞中过表达circNFIX，同时敲低LIN28B，检测SH3RF3的表达变化。
拯救实验：SH3RF3过表达对circNFIX敲低效应的影响
验证SH3RF3是否参与circNFIX介导的细胞功能调控。
在A2780和SKOV3细胞中共转染sh-circNFIX和pcDNA3.1-SH3RF3，检测细胞增殖、迁移、侵袭和干性能力的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RMPI-1640培养基 | Procell | -- |
| DMEM培养基 | Procell | -- | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| cDNA逆转录试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| qPCR | SYBR Premix Ex Taq试剂盒 | TaKaRa | -- |
| ABI 7900系统 | -- | -- | |
| RNase R处理 | 核糖核酸酶R | Epicenter | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Biosharp | BL521A | |
| SDS-PAGE凝胶 | Meilunbio | MB2479 | |
| SH3RF3抗体 | Abcam | ab184977 | |
| LIN28B抗体 | CST | 11965 | |
| N-钙粘蛋白抗体 | Proteintech | 66219-1-Ig | |
| E-钙粘蛋白抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| SOX2抗体 | Proteintech | 11064-1-AP | |
| OCT4抗体 | Proteintech | 60242-1-Ig | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| HRP偶联二抗 | Abcam | ab7153 | |
| Immobilon ECL底物试剂盒 | Millipore | -- | |
| Chemiscope6100软件 | -- | -- | |
| CCK-8检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo | -- |
| Bio-Tek酶标仪 | Heales | -- | |
| Transwell检测 | Transwell小室 | Corning | 8 |
| Matrigel基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| 倒置显微镜 | Beijing Cnmicro | -- | |
| 成球实验 | 重组碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- |
| 重组表皮生长因子 | -- | -- | |
| RNA免疫沉淀 | EZMagna RNA免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| IgG抗体 | CST | 14708 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 患者数量、组织类型、纳入标准、样本存储条件 阅读提示：参见Materials and Methods 2.1节 |
| 细胞培养 | 细胞系、培养基、血清浓度、培养条件 阅读提示：参见Materials and Methods 2.2节 |
| 细胞转染 | 转染试剂、转染时间、质粒和shRNA序列 阅读提示：参见Materials and Methods 2.3节 |
| qPCR | 引物序列、内参基因、计算方法 阅读提示：参见Materials and Methods 2.4节 |
| Western blot | 抗体批号、稀释比例、孵育条件 阅读提示：参见Materials and Methods 2.6节 |
| CCK-8检测 | 细胞接种密度、检测时间点、孵育时间 阅读提示：参见Materials and Methods 2.7节 |
| Transwell检测 | 小室孔径、细胞密度、迁移/侵袭时间、染色条件 阅读提示：参见Materials and Methods 2.8节 |
| 成球实验 | 细胞密度、培养时间、培养基成分 阅读提示：参见Materials and Methods 2.9节 |
| RIP实验 | 抗体、裂解条件、磁珠、检测RNA 阅读提示：参见Materials and Methods 2.11节 |
| 统计方法 | 统计检验方法、重复次数、显著性水平 阅读提示：参见Materials and Methods 2.12节 |