生物信息学筛选和高表达验证
筛选与Keap1结合的潜在miRNA，并验证其在乳腺癌中的表达。
在GEO数据集GSE154255中分析差异表达miRNA，结合Targetscan预测靶向Keap1的miRNA，取交集获得miR-141-3p；通过qRT-PCR在乳腺癌细胞系和正常细胞系中验证miR-141-3p表达。
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miR-141-3p通过Keap1-Nrf2信号通路减轻铁死亡促进乳腺癌紫杉醇耐药
miR-141-3p promotes paclitaxel resistance by attenuating ferroptosis via the Keap1-Nrf2 signaling pathway in breast cancer.
实验完整度
高结合体外细胞实验、双荧光素酶报告实验、分子机制验证以及体内裸鼠移植瘤模型，涵盖多个独立证据层级。
主要模型
MCF-7乳腺癌细胞系 MDA-MB-231乳腺癌细胞系 MCF-10A正常乳腺上皮细胞系 293T细胞系 裸鼠乳腺癌皮下移植瘤模型
重点核对
乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中miR-141-3p过表达或抑制 Keap1 3'UTR双荧光素酶报告基因验证 paclitaxel处理浓度：MCF-7为20 nM，MDA-MB-231为30 nM ML385处理浓度2 μM 动物实验中紫杉醇剂量20 mg/kg，每2天腹腔注射，共7次
摘要
目的：乳腺癌严重威胁全球女性的生命健康。然而，耐药性使得乳腺癌的治疗面临挑战。本研究旨在探讨miR-141-3p对乳腺癌紫杉醇耐药的影响及其潜在机制。方法：利用生物信息学分析和qRT-PCR探讨潜在分子miR-141-3p。通过双荧光素酶报告基因实验确定miR-141-3p与Keap1的特异性结合。利用qRT-PCR和Western blot观察miR-141-3p、Keap1、Nrf2、SLC7A11和GPX4的表达。采用GSH/GSSG含量、MDA含量和JC-1实验观察乳腺癌细胞的铁死亡水平。采用CCK-8实验观察乳腺癌细胞的活力。通过皮下移植瘤实验了解miR-141-3p在体内对乳腺癌紫杉醇耐药的影响。结果：本研究发现miR-141-3p在乳腺癌中高表达，并与不良预后相关。miR-141-3p抑制Keap1表达，促进Nrf2表达，并促进乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药。抑制miR-141-3p可促进Keap1表达，抑制Nrf2及其下游SLC7A11-GSH-GPX4信号通路，同时促进癌细胞铁死亡，并抑制紫杉醇和RSL3耐药。ML385阻断miR-141-3p对乳腺癌细胞紫杉醇耐药和铁死亡耐受的影响。在体内，miR-141-3p模拟物促进紫杉醇耐药，而miR-141-3p抑制剂则抑制乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药。结论：本研究揭示miR-141-3p通过调控Keap1-Nrf2信号通路调节铁死亡，从而促进乳腺癌细胞的紫杉醇耐药。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miR-141-3p是否通过调控Keap1-Nrf2信号通路影响乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药，其具体机制是什么。
- 核心机制
- miR-141-3p通过靶向抑制Keap1，激活Nrf2及其下游SLC7A11-GSH-GPX4抗铁死亡通路，从而减弱铁死亡，促进乳腺癌细胞紫杉醇耐药。
- 主要证据
- 体外实验显示miR-141-3p过表达抑制Keap1、激活Nrf2，增强紫杉醇耐药；抑制miR-141-3p则促发铁死亡并逆转耐药。体内裸鼠移植瘤实验证实miR-141-3p过表达促进紫杉醇耐药，抑制则相反。
- 研究意义
- 本研究为乳腺癌化疗提供新思路，靶向抑制miR-141-3p可能成为克服紫杉醇耐药的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
双荧光素酶报告基因验证靶向结合
验证miR-141-3p与Keap1 3'UTR的特异性结合。
构建Keap1 3'UTR野生型和突变型质粒，与miR-141-3p mimics共转染293T细胞，检测荧光强度。
体外过表达和抑制实验
观察miR-141-3p对Keap1-Nrf2通路及紫杉醇耐药的影响。
在MCF-7和MDA-MB-231细胞中转染miR-141-3p mimics或inhibitors，检测细胞活力、相关蛋白表达及IC50。
铁死亡水平检测
评估抑制miR-141-3p对乳腺癌细胞铁死亡的影响。
检测SLC7A11和GPX4表达、GSH/GSSG比值、MDA含量、线粒体膜电位及RSL3的IC50。
Nrf2抑制剂干预实验
验证miR-141-3p的作用是否依赖Nrf2。
使用ML385抑制Nrf2，观察miR-141-3p对铁死亡和紫杉醇耐药的影响。
体内移植瘤模型验证
在体内验证miR-141-3p对紫杉醇耐药的作用。
构建稳定转染miR-141-3p mimics或inhibitors的MDA-MB-231细胞系，皮下接种裸鼠，腹腔注射紫杉醇，比较肿瘤体积和重量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素和链霉素 | -- | -- | |
| Opti-MEM培养基 | -- | -- | |
| 质粒转染 | Lip2000转染试剂 | Thermo | 11668019 |
| miR-141-3p模拟物 | GenePharma | -- | |
| miR-141-3p抑制剂 | GenePharma | -- | |
| miR-NC模拟物 | GenePharma | -- | |
| miR-NC抑制剂 | GenePharma | -- | |
| 慢病毒感染 | 病毒载体 | GenePharma | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 紫杉醇 | -- | -- |
| ML385 | -- | -- | |
| RSL3 | -- | -- | |
| 双荧光素酶报告实验 | Keap1 3'UTR野生型质粒 | GenePharma | -- |
| Keap1 3'UTR突变型质粒 | GenePharma | -- | |
| 荧光素酶试剂盒 | -- | -- | |
| qRT-PCR | M5茎环miRNA cDNA合成试剂盒 | Mei5Bio | MF878-01 |
| 茎环miRNA荧光定量检测试剂盒 | Mei5Bio | MF879 | |
| PrimeScript™逆转录预混液 | Takara | RR036A | |
| 2X M5 UltraSYBR混合物（低ROX） | Mei5Bio | MF015 | |
| 引物 | Sangon Biotech | -- | |
| Western blot | 核浆蛋白提取试剂盒 | Beyotime | P0027 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Kangwei | CW014 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 兔抗Keap1多克隆抗体 | Proteintech | 10503-2-AP | |
| 兔抗Nrf2多克隆抗体 | Proteintech | 16396-1-AP | |
| 小鼠抗GPX4单克隆抗体 | Proteintech | 67763-1-Ig | |
| 兔抗SLC7A11多克隆抗体 | Proteintech | 36864-1-AP | |
| 小鼠抗GAPDH单克隆抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗α-微管蛋白单克隆抗体 | Proteintech | 66031-1-Ig | |
| 小鼠抗组蛋白H3单克隆抗体 | Proteintech | 68345-1-Ig | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| CCK-8实验 | CCK-8试剂盒 | Biosharp | BS350B |
| MDA检测 | 丙二醛（MDA）含量检测试剂盒 | Solarbio | BC0025 |
| JC-1实验 | JC-1线粒体膜电位检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C2006 |
| 动物实验 | 裸鼠 | Jinan Pengyue Laboratory Animal Breeding Co. | -- |
| 统计 | GraphPad Prism 9.0 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231），培养基（DMEM+10%FBS+1%双抗），培养条件（37°C，5% CO2），传代比例（1:2，融合度85%-90%） 阅读提示：参见Materials and Methods中的Cell culture部分 |
| 质粒转染 | 转染试剂Lip2000，质粒和Lip2000的比例（MCF-7 1:1，MDA-MB-231 1:0.8），细胞密度（1×10^5/六孔板），转染时间（6h），检测时间点（qRT-PCR 24h，Western blot 48h） 阅读提示：参见Materials and Methods中的Plasmid transfection and viral infection部分 |
| 药物处理 | paclitaxel浓度（MCF-7 20 nM，MDA-MB-231 30 nM），ML385浓度（2 μM），处理时间（转染后24-36h） 阅读提示：参见Materials and Methods中的Plasmid transfection and viral infection部分 |
| 双荧光素酶报告实验 | 293T细胞，Keap1 3'UTR野生型和突变型质粒，miR-141-3p mimics共转染，检测时间（36-48h） 阅读提示：参见Materials and Methods中的Dual luciferase reporter assay部分 |
| qRT-PCR | RNA提取、逆转录试剂、PCR试剂、引物序列（表1）、反应条件按说明书 阅读提示：参见Materials and Methods中的qRT-PCR assay部分及Table 1 |
| Western blot | 蛋白提取方法（全蛋白和核蛋白提取），BCA定量，SDS-PAGE，PVDF膜，封闭液（5%脱脂牛奶），一抗和二抗孵育条件 阅读提示：参见Materials and Methods中的Western blot assay部分及Table 2 |
| CCK-8实验 | 细胞密度（每孔3000-5000个），CCK-8溶液添加量，孵育时间（37°C 1-4h），检测波长450 nm 阅读提示：参见Materials and Methods中的CCK-8 assay部分 |
| 体内实验 | 动物品系（4周龄裸鼠），分组（3组，每组7只），细胞接种量（5×10^6），紫杉醇剂量（20 mg/kg），给药方案（第10天起每2天一次，共7次），取材时间（第30天） 阅读提示：参见Materials and Methods中的In vivo tumorigenesis assay部分及Figure 6 legend |