RNA结合蛋白THUMPD2抑制上皮性卵巢癌增殖并促进转移

RNA-binding protein THUMPD2 inhibits proliferation and promotes metastasis in epithelial ovarian cancer.

作者信息Minhui Hua, Yujie Chen, Meiqun Jia, Wenxuan Lv, Yunzhao Xu, Yuquan Zhang
PMID39071668
期刊Heliyon
发布时间2024-06-25
DOI10.1016/j.heliyon.2024.e33201

实验完整度

包含患者组织IHC和qRT-PCR、细胞系功能实验(增殖、迁移、侵袭)、体内异种移植模型以及RNA-seq和GO/KEGG机制分析等至少两个独立证据层级。

主要模型

OVCAR3和SKOV3卵巢癌细胞系 BALB/c裸鼠皮下异种移植模型 卵巢癌患者组织样本(47例癌和30例良性)

重点核对

THUMPD2表达水平与FIGO分期的关联(早期低表达,晚期高表达) THUMPD2敲低和过表达对细胞增殖、迁移和侵袭的影响 体内异种移植实验中THUMPD2对肿瘤生长的影响 RNA-seq中差异表达基因的筛选标准(adjusted P<0.05,|log2foldchange|>1)

摘要

卵巢癌(OC)是一种常见且致命的妇科恶性肿瘤。RNA结合蛋白(RBPs)在调控RNA代谢中发挥关键作用,并已涉足多种癌症的发生与发展。RBPs表达或活性的细微改变可诱导调控网络发生显著变化。THUMPD2作为RBP家族成员,在卵巢癌中被发现有差异表达,但其机制尚未研究。在本研究中,发现THUMPD2蛋白在OC早期(I+II期)弱表达(P=0.013),低表达率为78.6%,在晚期(III+IV期)高表达(P=0.009),高表达率为84.8%。在OVCAR3和SKOV3细胞中,shRNA介导的THUMPD2敲低导致细胞增殖增加但抑制转移,而THUMPD2过表达则具有相反效果。THUMPD2过表达在体内抑制肿瘤生长。相反,THUMPD2低表达促进肿瘤生长。此外,我们通过GO和KEGG分析鉴定了THUMPD2的潜在靶基因和通路,这些与中心体、微管、细胞周期和细胞外基质相关。我们证明了早期THUMPD2低表达促进肿瘤生长,晚期高表达促进肿瘤转移。我们的发现揭示了THUMPD2在OC中的双重功能,并提示THUMPD2可能作为治疗OC的治疗靶点。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
THUMPD2在上皮性卵巢癌中的表达模式及其对肿瘤增殖和转移的影响和潜在机制是什么?
核心机制
THUMPD2通过调控与中心体、微管细胞骨架组织、细胞周期和细胞外基质组织相关的基因,抑制早期肿瘤增殖并促进晚期肿瘤转移。
主要证据
基于患者组织IHC和qRT-PCR显示THUMPD2早期低表达和晚期高表达;细胞功能实验(CCK-8、集落形成、划痕、Transwell)证明THUMPD2抑制增殖促进迁移侵袭;体内异种移植实验验证其对肿瘤生长的影响;RNA-seq和GO/KEGG分析揭示下游通路。
研究意义
THUMPD2在OC中具有双重功能,可能作为OC治疗的潜在治疗靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

THUMPD2表达分析

检测THUMPD2在卵巢癌组织中的表达水平及其与临床病理特征的关系

对47例OC和30例良性组织进行IHC染色,对26例组织样本(18例癌和8例正常)进行qRT-PCR,并使用TCGA/GTEx数据库进行泛癌分析。

2

细胞增殖和转移功能实验

验证THUMPD2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

在OVCAR3和SKOV3细胞中稳定敲低或过表达THUMPD2,进行CCK-8、集落形成、划痕愈合和Transwell迁移/侵袭实验。

3

体内异种移植实验

验证THUMPD2对体内肿瘤生长的影响

将THUMPD2敲低、过表达和对照OVCAR3细胞皮下注射到裸鼠腋窝,28天后解剖肿瘤并称重。

4

转录组测序及通路分析

探究THUMPD2调控的下游基因和信号通路

对sh-THUMPD2和对照OVCAR3细胞进行RNA-seq,筛选DEGs并进行GO和KEGG富集分析,并通过Western blot验证部分蛋白表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
RPMI 1640培养基Biological Industries01-100-1B
胎牛血清Biological Industries#1928703
青霉素和链霉素Beyotime Biotechnology--
pGreenPuro shRNA慢病毒载体System BiosciencesSI505A-1
pEGFP-N1载体Addgene60360
jetPRIME转染试剂Polyplus101000046
嘌呤霉素Santa Cruzsc-108071
Trizol试剂Sangon BiotechB511311
HiScript III逆转录试剂盒VazymeR312
SYBR Green荧光染料VazymeQ711
PVDF膜MerckIPVH00010
THUMPD2抗体Santa Cruzsc-393018
CDK6抗体CST#13331
MIB1抗体Santa Cruzsc-393811
APC抗体Abcamab40778
RB1抗体Proteintech10048-2-Ig
PTPN11抗体Proteintech24570-1-AP
β-actin抗体Proteintech81115-1-RR
增强化学发光试剂盒MilliporeWBULS0500
CCK-8试剂盒DojindoCK04
Illumina HiSeq 2500测序平台Illumina--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系OVCAR3和SKOV3,培养基RPMI 1640+10%FBS+青霉素/链霉素,37°C,5%CO2
阅读提示:Materials and methods 2.1
基因敲低和过表达
THUMPD2 shRNA2序列,pGreenPuro载体,pEGFP-N1过表达载体,jetPRIME转染,嘌呤霉素和neomycin筛选浓度及时间
阅读提示:Materials and methods 2.2 和 Table 1
细胞增殖和转移功能检测
CCK-8检测时间点,集落形成接种密度和培养时间,划痕实验观察时间,Transwell侵袭和迁移实验的Matrigel使用和培养时间
阅读提示:Materials and methods 2.6, 2.7, 2.8
体内异种移植实验
小鼠品系、年龄、体重,细胞注射数量、体积和部位,实验周期28天
阅读提示:Materials and methods 2.9
RNA-seq分析
细胞处理(sh-THUMPD2和scramble),测序平台,差异表达基因筛选标准
阅读提示:Materials and methods 2.14 和 Results 3.6