THUMPD2表达分析
检测THUMPD2在卵巢癌组织中的表达水平及其与临床病理特征的关系
对47例OC和30例良性组织进行IHC染色,对26例组织样本(18例癌和8例正常)进行qRT-PCR,并使用TCGA/GTEx数据库进行泛癌分析。
RNA-binding protein THUMPD2 inhibits proliferation and promotes metastasis in epithelial ovarian cancer.
包含患者组织IHC和qRT-PCR、细胞系功能实验(增殖、迁移、侵袭)、体内异种移植模型以及RNA-seq和GO/KEGG机制分析等至少两个独立证据层级。
OVCAR3和SKOV3卵巢癌细胞系 BALB/c裸鼠皮下异种移植模型 卵巢癌患者组织样本(47例癌和30例良性)
THUMPD2表达水平与FIGO分期的关联(早期低表达,晚期高表达) THUMPD2敲低和过表达对细胞增殖、迁移和侵袭的影响 体内异种移植实验中THUMPD2对肿瘤生长的影响 RNA-seq中差异表达基因的筛选标准(adjusted P<0.05,|log2foldchange|>1)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测THUMPD2在卵巢癌组织中的表达水平及其与临床病理特征的关系
对47例OC和30例良性组织进行IHC染色,对26例组织样本(18例癌和8例正常)进行qRT-PCR,并使用TCGA/GTEx数据库进行泛癌分析。
验证THUMPD2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响
在OVCAR3和SKOV3细胞中稳定敲低或过表达THUMPD2,进行CCK-8、集落形成、划痕愈合和Transwell迁移/侵袭实验。
验证THUMPD2对体内肿瘤生长的影响
将THUMPD2敲低、过表达和对照OVCAR3细胞皮下注射到裸鼠腋窝,28天后解剖肿瘤并称重。
探究THUMPD2调控的下游基因和信号通路
对sh-THUMPD2和对照OVCAR3细胞进行RNA-seq,筛选DEGs并进行GO和KEGG富集分析,并通过Western blot验证部分蛋白表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Biological Industries | 01-100-1B |
| 胎牛血清 | Biological Industries | #1928703 | |
| 青霉素和链霉素 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 细胞转染 | pGreenPuro shRNA慢病毒载体 | System Biosciences | SI505A-1 |
| pEGFP-N1载体 | Addgene | 60360 | |
| jetPRIME转染试剂 | Polyplus | 101000046 | |
| 嘌呤霉素 | Santa Cruz | sc-108071 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Sangon Biotech | B511311 |
| 逆转录 | HiScript III逆转录试剂盒 | Vazyme | R312 |
| qPCR | SYBR Green荧光染料 | Vazyme | Q711 |
| Western blot | PVDF膜 | Merck | IPVH00010 |
| THUMPD2抗体 | Santa Cruz | sc-393018 | |
| CDK6抗体 | CST | #13331 | |
| MIB1抗体 | Santa Cruz | sc-393811 | |
| APC抗体 | Abcam | ab40778 | |
| RB1抗体 | Proteintech | 10048-2-Ig | |
| PTPN11抗体 | Proteintech | 24570-1-AP | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 81115-1-RR | |
| 增强化学发光试剂盒 | Millipore | WBULS0500 | |
| 细胞增殖实验 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | CK04 |
| RNA-seq | Illumina HiSeq 2500测序平台 | Illumina | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系OVCAR3和SKOV3,培养基RPMI 1640+10%FBS+青霉素/链霉素,37°C,5%CO2 阅读提示:Materials and methods 2.1 |
| 基因敲低和过表达 | THUMPD2 shRNA2序列,pGreenPuro载体,pEGFP-N1过表达载体,jetPRIME转染,嘌呤霉素和neomycin筛选浓度及时间 阅读提示:Materials and methods 2.2 和 Table 1 |
| 细胞增殖和转移功能检测 | CCK-8检测时间点,集落形成接种密度和培养时间,划痕实验观察时间,Transwell侵袭和迁移实验的Matrigel使用和培养时间 阅读提示:Materials and methods 2.6, 2.7, 2.8 |
| 体内异种移植实验 | 小鼠品系、年龄、体重,细胞注射数量、体积和部位,实验周期28天 阅读提示:Materials and methods 2.9 |
| RNA-seq分析 | 细胞处理(sh-THUMPD2和scramble),测序平台,差异表达基因筛选标准 阅读提示:Materials and methods 2.14 和 Results 3.6 |