生物信息学分析CDC45表达与预后
评估CDC45在HCC中的表达及其与患者预后的关系。
利用UCSC Xena和ICGC数据库分析CDC45 mRNA表达，Kaplan-Meier生存分析评估预后。
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IGF2BP2通过m6A修饰稳定CDC45 mRNA促进肝细胞癌糖酵解和干性
IGF2BP2 promotes glycolysis and hepatocellular carcinoma stemness by stabilizing CDC45 mRNA via m6A modification.
实验完整度
高含有体外细胞实验、体内动物实验、生信分析等多层级验证，并进行了功能回复实验机制验证。
主要模型
SK-Hep-1细胞 HCC-LM3细胞 HepG2细胞 Huh7细胞 BALB/C裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
CDC45在HCC组织高表达，且与患者预后不良相关（生物信息学分析） 敲低CDC45后，HCC细胞增殖、迁移、侵袭、EMT、干性和糖酵解受抑，凋亡增加（体外实验） 敲低CDC45后，裸鼠移植瘤生长减慢，肿瘤重量降低，EMT、干性及糖酵解标志物表达改变（体内实验） IGF2BP2与CDC45 mRNA结合，敲低IGF2BP2降低CDC45 mRNA稳定性，且IGF2BP2过表达效应可被CDC45敲低逆转（机制实验）
摘要
越来越多的研究显示细胞分裂周期蛋白45（CDC45）在肝细胞癌（HCC）中的预后重要性。本研究旨在探讨CDC45在HCC中的生物学功能及机制。通过生物信息学分析CDC45在HCC和正常组织中的差异表达及预后意义。敲低CDC45后，在体外和体内检测CDC45对HCC的生物学效应。随后，利用RNA m6A比色法和甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）评估细胞内总RNA和CDC45的m6A修饰水平。应用RIP证实CDC45与胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IGF2BP2）相互作用。使用放线菌素D实验检测CDC45 mRNA的稳定性。此外，通过过表达IGF2BP2探讨IGF2BP2对CDC45表达的调控作用及其在HCC进展中的作用。CDC45高表达与HCC患者预后不良相关。敲低CDC45抑制HCC细胞增殖、迁移、侵袭、EMT、干性和糖酵解，并促进凋亡，这在体外实验中得到验证。此外，IGF2BP2在HCC细胞中高表达，并与CDC45相互作用。敲低IGF2BP2导致CDC45 mRNA稳定性降低。而且，过表达IGF2BP2促进HCC细胞增殖、迁移、侵袭、EMT、干性和糖酵解，同时抑制凋亡，而这些效应可被敲低CDC45逆转。总的来说，IGF2BP2通过m6A修饰稳定CDC45 mRNA，从而促进HCC糖酵解和干性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CDC45在肝细胞癌中的生物学功能及其上游调控机制是什么？
- 核心机制
- IGF2BP2以m6A依赖性方式结合并稳定CDC45 mRNA，从而促进HCC细胞糖酵解和干性。
- 主要证据
- 生物信息学分析显示CDC45高表达与HCC患者不良预后相关；体外敲低CDC45抑制细胞增殖、迁移、侵袭、EMT、干性和糖酵解，促进凋亡；体内敲低CDC45抑制肿瘤生长；RIP证明IGF2BP2与CDC45 mRNA相互作用，放线菌素D实验证明IGF2BP2敲低降低CDC45 mRNA稳定性，且IGF2BP2过表达效应可被CDC45敲低逆转。
- 研究意义
- CDC45可能作为HCC潜在的生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外敲低CDC45功能实验
验证CDC45对HCC细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、EMT、干性和糖酵解的影响。
在SK-Hep-1细胞中敲低CDC45，进行CCK-8、克隆形成、划痕、Transwell、流式凋亡、蛋白质印迹、成球实验，并检测糖酵解指标。
体内敲低CDC45实验
验证CDC45在体内对HCC肿瘤生长的影响。
将敲低CDC45的SK-Hep-1细胞皮下注射入裸鼠，监测肿瘤体积和重量，并进行HE染色及qRT-PCR、WB检测。
IGF2BP2调控CDC45机制实验
验证IGF2BP2是否通过m6A修饰影响CDC45 mRNA稳定性。
比较SK-Hep-1和LX2细胞中m6A水平，RIP检测IGF2BP2与CDC45结合，敲低IGF2BP2后检测CDC45 mRNA稳定性及m6A水平。
IGF2BP2过表达与CDC45敲低回复实验
验证IGF2BP2对HCC细胞功能的影响是否依赖CDC45。
在SK-Hep-1细胞中过表达IGF2BP2，同时敲低CDC45，检测增殖、迁移、侵袭、凋亡、EMT、干性、糖酵解指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MEM培养基 | Gibco | 11095080 |
| DMEM培养基 | -- | AW-MC002 | |
| RPMI-1640培养基 | -- | AW-MC002 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| sh-IGF2BP2质粒 | HonorGene | HG-HS1007225 | |
| oe-IGF2BP2质粒 | HonorGene | HG-HO1007225 | |
| sh-NC对照质粒 | HonorGene | HG-shNC01 | |
| oe-NC对照质粒 | HonorGene | HG-VPH1305 | |
| 慢病毒包装 | sh-CDC45质粒 | -- | HG-HS1178010 |
| sh-NC对照质粒 | -- | LV-shNC | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | DOJINDO | NU679 |
| 细胞染色 | 结晶紫染色液 | Solarbio | G1062 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡试剂盒 | KeyGen | KGA1030 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596026 |
| 反转录PCR | mRNA反转录试剂盒 | CWBIO | CW2569 |
| qRT-PCR | Ultra SYBR Mixture | CWBIO | CW2601 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Abiowell | AWB0136 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Biosharp | BL521A | |
| CDC45抗体 | Proteintech | 15678-1-AP | |
| IGF2BP2抗体 | Proteintech | 11601-1-AP | |
| N-cadherin抗体 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| Vimentin抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| E-cadherin抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| CD133抗体 | Proteintech | 18470-1-AP | |
| Nanog抗体 | Proteintech | 14295-1-AP | |
| SOX2抗体 | Proteintech | 11064-1-AP | |
| OCT4抗体 | Proteintech | 11263-1-AP | |
| HIF-1α抗体 | Abcam | ab179483 | |
| HK-2抗体 | Proteintech | 22029-1-AP | |
| GLUT1抗体 | Proteintech | 21829-1-AP | |
| PKM2抗体 | Proteintech | 15822-1-AP | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 | |
| m6A检测 | m6A RNA甲基化定量试剂盒（比色法） | Abcam | ab185912 |
| m6A抗体 | Abcam | ab286164 | |
| MeRIP | Magna MeRIP m6A试剂盒 | Millipore | -- |
| RIP | Magna RIP试剂盒 | Millipore | -- |
| IgG抗体 | Abcam | ab48386 | |
| 生化检测 | 葡萄糖检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | F006-1 |
| 荧光乳酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A019-2-1 | |
| 发光ATP检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A095-1-1 | |
| 细胞培养 | B27添加剂 | -- | -- |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| 肝素 | -- | -- | |
| 动物模型 | BALB/c裸鼠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养基：SK-Hep-1、HCC-LM3、HepG2用MEM，Huh7用DMEM，LX2用RPMI-1640；所有培养基添加10%FBS和1%青霉素-链霉素；培养条件为37°C、5%CO2。 阅读提示：Materials and methods, Cell culture |
| 细胞转染 | 质粒：sh-IGF2BP2、oe-IGF2BP2、sh-NC、oe-NC；转染试剂：Lipofectamine 2000；质粒用量为5μl，转染后6h换液，48h后检测。 阅读提示：Materials and methods, Cell transfection |
| 基因敲低效果验证 | sh-CDC45#3和sh-IGF2BP2#2被证实敲低效率最高，用于后续实验。 阅读提示：Results, 图2a和图6e |
| 体内实验 | 动物：雄性BALB/c裸鼠，4周龄；细胞接种量：3×10^6个细胞/150μl；皮下注射部位：左腋下；实验时间38天；麻醉：1.25%戊巴比妥；肿瘤体积每两周测量。 阅读提示：Materials and methods, Animal experiment |
| m6A机制实验 | m6A检测：使用m6A RNA甲基化定量试剂盒（ab185912）；MeRIP：使用Magna MeRIP m6A Kit；RIP：使用Magna RIP kit和IGF2BP2抗体；放线菌素D处理浓度5μg/mL，时间0,2,4,6,8小时。 阅读提示：Materials and methods, Global mRNA m6A methylation, MeRIP-PCR, RIP assay, Actinomycin D experiment |