聚多巴胺包被的仿生骨支架负载外泌体促进BMSC成骨分化及骨再生

Polydopamine-coated biomimetic bone scaffolds loaded with exosomes promote osteogenic differentiation of BMSC and bone regeneration.

作者信息Yi Zhou, Guozhen Deng, Hongjiang She, Fan Bai, Bingyan Xiang, Jian Zhou, Shuiqin Zhang
PMID37063095
发布时间2023-03-30
DOI10.1016/j.reth.2023.03.005

实验完整度

包含体外细胞实验(增殖、成骨分化)、支架表征及体内兔桡骨缺损模型验证,且体内外结果相互支撑。

主要模型

兔骨髓间充质干细胞(BMSCs) SCN/PDA-Exo功能化复合支架 兔桡骨临界缺损模型

重点核对

外泌体载荷及缓释特性:SCN/PDA支架吸附外泌体总量为263.8±17.2 μg,释放持续至21天 BMSC增殖效果:CCK-8检测显示SCN/PDA-Exo组增殖显著高于其他组 成骨分化标志物:Runx2、Col-1、OCN、BMP-2表达水平 体内骨再生效果:3D-CT、BMD、新骨形成面积 动物模型:兔桡骨15 mm缺损,植入后12周评估

摘要

骨缺损的修复理想地通过骨组织工程完成。最近的研究探索了骨组织工程中支架功能修饰的可能性。我们制备了SF-CS-nHA(SCN)仿生骨支架,并通过添加负载骨髓间充质干细胞(BMSCs)外泌体(Exos)的聚多巴胺(PDA)涂层对支架材料进行功能修饰。研究了功能复合支架(SCN/PDA-Exo)对BMSC增殖和成骨分化的影响。此外,将SCN/PDA-Exo支架植入动物体内以评估其对骨再生的影响。方法:通过真空冷冻干燥/化学交联方法制备SCN仿生支架。通过表面涂层方法添加负载BMSC-Exos的PDA功能化涂层。通过扫描电子显微镜(SEM)、能谱分析和接触角测试检测功能复合支架的物理和化学性质。体外,将BMSCs接种在不同支架上,通过共聚焦显微镜检测BMSCs对外泌体的内化。通过SEM、CCK-8测定和鬼笔环肽染色检测BMSC增殖活性和细胞形态。通过免疫荧光、茜素红染色和qRT-PCR检测BMSC成骨分化。体内,将功能复合支架植入兔临界桡骨缺损模型中。通过3D-CT扫描检测骨修复。使用HE染色、Masson染色和免疫组织化学评估骨再生。结果:与SCN支架相比,SCN/PDA-Exo功能化复合支架具有更大的平均表面粗糙度和更强的亲水性。体外,固定在SCN/PDA-Exo支架上的Exos被BMSCs内化。SCN/PDA-Exo组的BMSC形态、增殖能力和成骨分化效果显著优于其他对照组(p < 0.05)。SCN/PDA-Exo功能复合支架对骨缺损修复和新骨形成的作用显著优于其他对照组(p < 0.05)。结论:本研究发现SCN/PDA-Exo功能化复合支架在体外促进BMSC增殖和成骨分化,并在体内提高骨再生效率。因此,通过功能性PDA涂层将外泌体与仿生骨支架结合可能是功能修饰生物支架的有效策略。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
如何通过功能化修饰骨组织工程支架来促进BMSC成骨分化和骨再生?
核心机制
通过聚多巴胺涂层负载BMSC来源外泌体,实现外泌体的持续释放和被BMSC内化,从而促进BMSC增殖和成骨分化。
主要证据
体外实验显示SCN/PDA-Exo促进BMSC增殖、ALP活性和矿化结节形成,并上调成骨基因表达;体内实验显示该支架促进兔桡骨缺损修复和新骨形成。
研究意义
将外泌体与仿生骨支架结合可能是功能修饰生物支架的有效策略,为骨缺损修复提供潜在的应用方向。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

制备并表征SCN/PDA支架

制备仿生骨支架并进行功能化修饰,验证PDA涂层的成功附着及支架理化性能。

通过真空冷冻干燥/化学交联制备SCN支架,然后浸入多巴胺溶液形成PDA涂层。使用SEM、EDS、AFM、接触角测试、力学测试等表征支架的形貌、组成、粗糙度、亲水性和力学性能。

2

提取并鉴定BMSC外泌体

获取BMSC来源的外泌体并验证其特性。

收集BMSC条件培养基,通过差速离心和超速离心提取外泌体;TEM观察形态,NTA测量粒径,Western blot检测CD9、CD63、TSG101标志物;PKH67标记外泌体以观察内化。

3

评估外泌体负载与释放

比较SCN和SCN/PDA支架对外泌体的吸附及释放能力。

将支架浸入外泌体溶液,测定吸附量;在PBS中释放,定期收集 supernatant,测量外泌体释放动力学。

4

体外BMSC增殖和细胞毒性检测

评估支架对BMSC的细胞毒性和增殖影响。

将BMSC接种于不同支架共培养,活/死染色评估细胞毒性,CCK-8检测第1、3、7天增殖;SEM观察细胞形态。

5

体外成骨分化检测

评估支架对BMSC成骨分化的影响。

在成骨诱导培养基中培养BMSC,通过ALP染色、茜素红染色、免疫荧光检测Runx2和Col-1,qRT-PCR检测成骨基因表达。

6

体内骨缺损修复效果评估

评估SCN/PDA-Exo支架在体内促进骨再生的能力。

在兔桡骨建立15 mm临界缺损模型,植入不同支架,12周后通过3D-CT、BMD、组织学染色和免疫组化评估骨修复。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
α-MEM培养基Solarbio--
胎牛血清Gibco--
BCA蛋白定量试剂盒Solarbio--
PKH67绿色荧光染料SolarbioD0031
DAPI染色液SolarbioC0065
鬼笔环肽Beyotime--
钙黄绿素和碘化丙啶BeyotimeC2015S
抗CD9抗体Abcamab236630
抗CD63抗体Abcamab134045
抗TSG101抗体Abcamab125011
抗Runx2抗体Abcamab76956
抗Col-1抗体GeneTexGTX26308
抗CD31抗体Abcamab213175
TRIzol试剂----
PrimerScript反转录预混液TaKaRa--
SYBR预混Ex TaqTaKaRa--
壳聚糖Aladdin--
纳米羟基磷灰石Aladdin--
氯化钙Aladdin--
乙醇Aladdin--
甲醇Aladdin--
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐Aladdin--
N-羟基琥珀酰亚胺Aladdin--
盐酸多巴胺Aladdin--
Tris-HCl缓冲液Tianjin Kemiou Chemical Reagent--
扫描电子显微镜HitachiSU8220
原子力显微镜BrukerDimension
材料力学试验机ShimadzuAGS-X
接触角测量仪SZ-CAMA1VCA
透射电子显微镜JEOLJEM-1400FLASH
纳米颗粒跟踪分析系统Particle MetrixZeta
激光共聚焦显微镜LeicaTCS
荧光显微镜OlympusIX53
3D-CT扫描仪PhilipsBrilliance
庆大霉素----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
支架制备
SCN支架制备中SF、CS、nHA浓度为4%,混合比例1:1:1;PDA涂层浓度4 mg/mL,浸泡24小时
阅读提示:2.1节 Preparation and characterization of PDA/SCN scaffolds
外泌体提取和鉴定
BMSC培养条件(第三代,10% FBS α-MEM培养48小时);差速离心参数(300×g 10min, 2000×g 10min, 10000×g 30min, 100000×g 90min)
阅读提示:2.2节 Extraction, identification and internalization of BMSC-exos into cells
体外共培养
外泌体固定浓度1.8 μg/μL,300 μL/支架,4℃孵育12小时;BMSC接种密度2×10^5 cells/well(12孔板)或2×10^4 cells/well(96孔板)
阅读提示:2.3节 Coculture of functionalized scaffolds loaded with exos and BMSCs
成骨分化检测
成骨诱导培养基成分(10% FBS、100 IU/mL青霉素/链霉素、10 mM β-甘油磷酸、10 nM地塞米松、50 μg/mL抗坏血酸);检测时间点(ALP 7天、茜素红21天、免疫荧光7/14天、qRT-PCR 14天)
阅读提示:2.5节 Osteogenic differentiation of BMSCs
体内动物实验
兔品系(新西兰白兔,5-6个月龄,体重4.0±0.30 kg);缺损尺寸(15 mm长,3 mm直径);分组(空白对照、SCN、SCN/PDA、SCN/PDA-Exo);观察时间点12周
阅读提示:2.6节 Surgical procedure of the radial defect model