建立MCAO小鼠模型和OGD细胞模型
模拟缺血性卒中后的脑缺血再灌注损伤和体外缺氧缺血环境。
对C57BL/6J小鼠进行MCAO手术（缺血2小时，再灌注24小时），对bEnd.3细胞进行4小时OGD处理。
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三氟拉嗪通过MLCK/p-MLC通路调节血脑屏障通透性促进缺血性卒中恢复
Trifluoperazine regulates blood-brain barrier permeability via the MLCK/p-MLC pathway to promote ischemic stroke recovery.
实验完整度
高包含MCAO小鼠模型和OGD细胞模型，结合Western blot、免疫荧光、RT-qPCR、功能验证及MLCK过表达实验。
主要模型
C57BL/6J小鼠MCAO模型 bEnd.3细胞OGD模型 MLCK过表达慢病毒转染小鼠模型 MLCK过表达慢病毒转染bEnd.3细胞模型
重点核对
TFP给药剂量：10 mg/kg，于卒中诱导前30分钟和卒中后1小时腹腔注射 OGD处理时长：4小时氧糖剥夺，随后4小时复氧 MCAO手术：缺血2小时，再灌注24小时 MLCK过表达慢病毒注射：脑内注射0.5 μL，浓度2×10^9 TU/mL，于MCAO前4周 BBB通透性检测：EB和FITC-dextran尾静脉注射后1小时检测
摘要
摘要
生理学；分子生物学
关键词
学科领域：生理学，分子生物学
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TFP是否通过调控CaM/MLCK/p-MLC通路保护缺血性卒中后血脑屏障完整性并促进神经功能恢复？
- 核心机制
- TFP通过抑制CaM与MLCK结合，下调MLCK/p-MLC信号通路，减少肌动蛋白收缩，维持紧密连接蛋白完整性，降低BBB通透性。
- 主要证据
- 在MCAO小鼠和OGD处理的bEnd.3细胞中，TFP降低CaM表达、减少梗死体积、降低BBB通透性；MLCK过表达逆转TFP的保护效应。
- 研究意义
- 研究表明TFP抑制CaM与MLCK结合可能成为脑缺血后BBB损伤的治疗策略，为IS的临床治疗提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测BBB通透性和紧密连接蛋白表达
评估缺血性卒中后BBB损伤程度。
使用EB和FITC-dextran渗漏实验检测BBB通透性，通过免疫荧光和Western blot检测紧密连接蛋白ZO-1、claudin-5、occludin的表达。
TFP治疗并确定最佳剂量
确定TFP对MCAO小鼠的治疗效果及最佳给药剂量。
给予MCAO小鼠不同剂量TFP（2, 5, 10, 20 mg/kg），检测CaM表达，最终选择10 mg/kg。评估脑梗死体积、神经功能评分和BBB通透性。
验证MLCK在BBB调节中的作用
探究MLCK是否介导TFP对BBB的保护作用。
通过免疫荧光和Western blot检测MLCK表达，使用co-IP检测CaM与MLCK结合。利用MLCK过表达慢病毒转染bEnd.3细胞和小鼠，观察TFP保护效应的逆转。
检测MLCK/p-MLC通路激活水平
证实TFP通过抑制MLCK/p-MLC通路保护BBB。
通过Western blot和免疫荧光检测MLCK、p-MLC、MLC的表达，分析TFP对通路激活的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 三氟拉嗪 | Solarbio | 440-17-5 |
| 细胞培养 | 无糖DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11966025 |
| DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| 胎牛血清 | Inner Mongolia Opcel Biotechnology | BS-1105 | |
| 青霉素和链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 梗死体积检测 | 三苯基氯化四氮唑 | Solarbio | IT0160 |
| BBB通透性检测 | 伊文思蓝 | Sigma-Aldrich | E2129 |
| FITC-葡聚糖 | Sigma-Aldrich | FD40S-100MG | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | 20-188 |
| Western blot | 增强化学发光试剂 | MIKX | MK-S500 |
| 免疫共沉淀 | RIPA缓冲液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Yeasen | 20201ES76 |
| 细胞培养 | bEnd.3细胞系 | Procell | CL-0598 |
| 免疫荧光 | 山羊抗CD31抗体 | R&D | FAB3628G-100 |
| 兔抗Claudin-5抗体 | Abcam | ab15106 | |
| 兔抗Occludin抗体 | CST | 91131S | |
| 兔抗ZO-1抗体 | Invitrogen | 40-2200 | |
| Western blot | 兔抗ZO-1抗体 | Proteintech | 21773-1-AP |
| 兔抗MLCK抗体 | Abcam | ab76092 | |
| 免疫荧光 | 兔抗p-MLC抗体 | CST | 95777S |
| 抗兔Alexa Fluor 594二抗 | Abcam | ab150080 | |
| 抗兔Alexa Fluor 488二抗 | Abcam | ab150077 | |
| Western blot | 兔抗β-actin抗体 | CST | 4970 |
| 兔抗MLC抗体 | Abcam | ab92721 | |
| 兔抗CaM抗体 | Abcam | ab45689 | |
| 免疫共沉淀 | 小鼠抗CaM抗体 | Abcam | ab2860 |
| 蛋白A+G琼脂糖珠 | Beyotime | P2055 | |
| Western blot | 山羊抗兔IgG (H+L)二抗 | Elabscience | E-AB-1003 |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L)二抗 | Elabscience | E-AB-1001 | |
| ChemiDoc XRS Plus凝胶成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 荧光显微镜 | 蔡司Apotome 2荧光显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MCAO模型 | 小鼠品系、性别、年龄、体重；缺血时长2小时，再灌注24小时；麻醉方式：氯胺酮/赛拉嗪/乙酰丙嗪（50:5:1 mg/kg，腹膜内注射）；体温维持37℃±0.5℃。 阅读提示：详见STAR★Methods中的Animals和MCAO model mice and drug administration部分。 |
| TFP给药 | TFP剂量（10 mg/kg），给药时间（术前30分钟和术后1小时，腹腔注射），溶剂（生理盐水）。 阅读提示：详见Results中Figure 3 legend和STAR★Methods中的MCAO model mice and drug administration部分。 |
| OGD模型 | bEnd.3细胞培养条件；OGD处理时长4小时，复氧4小时；无糖DMEM和低氧环境（94% N2，5% CO2，1% O2）。 阅读提示：详见STAR★Methods中的Cell culture and reagents和Oxygen-glucose deprivation and reoxygenation部分。 |
| BBB通透性检测 | EB和FITC-dextran浓度（2%），注射体积（0.1 mL），检测时间（注射后1小时），荧光显微镜和定量分析。 阅读提示：详见STAR★Methods中的Evans blue dye assays部分。 |
| MLCK过表达实验 | 慢病毒载体GV341，注射剂量（0.5 μL，2×10^9 TU/mL），注射坐标，注射时间（MCAO前4周），细胞转染效率验证。 阅读提示：详见STAR★Methods中的Lentiviral transfection部分和图S1。 |