体外细胞活力检测
评估TCS对HCC细胞活力的影响
使用不同浓度TCS（0-400 μg/mL）处理H22细胞24、48、72小时，通过CCK-8法检测细胞活力。
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天花粉蛋白通过介导肝细胞癌中趋化因子和颗粒酶B的分泌促进抗肿瘤免疫
Trichosanthin Promotes Anti-Tumor Immunity through Mediating Chemokines and Granzyme B Secretion in Hepatocellular Carcinoma.
实验完整度
高包含体外细胞实验（细胞活力、凋亡检测）、体内异种移植模型（BALB/c小鼠）及免疫相关机制验证（CD8+ T细胞浸润、细胞因子检测）。
主要模型
H22小鼠肝癌细胞系 H22异种移植瘤BALB/c小鼠模型
重点核对
H22细胞系来源及培养条件（Procell, CL-0341） TCS处理剂量（体外：0-400 μg/mL；体内：0.5, 1, 2 μg/g） 体内给药时间（植入后第4、6、8、10、12、14、16天） 凋亡抑制剂Z-VAD-FMK浓度（40 μM） 动物模型：雄性BALB/c小鼠（5周龄，20 ± 2 g）
摘要
Trichosanthin（TCS）是从植物栝楼块根中提取的一种I型核糖体失活蛋白。TCS在临床药物流产、抗肿瘤和免疫调节方面显示出广阔的应用前景。然而，其抗肿瘤和免疫调节特性的分子机制仍未得到充分研究。在本研究中，我们在体外和体内研究了TCS在肝细胞癌（HCC）中的抗肿瘤活性。HCC细胞系和异种移植肿瘤组织在经TCS处理后均显示出显著的生长抑制。TCS在HCC细胞和异种移植肿瘤组织中诱导了caspase介导的细胞凋亡。TCS处理后，CD8+ T细胞向HCC组织的募集以及趋化因子CCL2和CCL22的表达得到促进。此外，TCS在HCC组织中诱导了颗粒酶B（GrzB）、TNF-α和IFN-γ的上调，这些是T细胞产生的主要细胞毒性介质。此外，TCS还导致HCC组织中甘露糖-6-磷酸受体（M6PR）——GrzB的主要受体——的增加。总之，这些结果表明TCS可能通过促进趋化因子的分泌和加速GrzB进入HCC细胞来增强T细胞免疫，这凸显了TCS在抗肿瘤免疫治疗中的潜在作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TCS是否能通过调节抗肿瘤免疫抑制肝细胞癌（HCC）的生长及其分子机制。
- 核心机制
- TCS通过促进趋化因子（CCL2、CCL22）分泌，招募CD8+ T细胞至肿瘤组织，并上调GrzB及M6PR表达，增强GrzB介导的HCC细胞凋亡。
- 主要证据
- 体外实验显示TCS抑制H22细胞活力并诱导caspase介导的凋亡；体内异种移植模型显示TCS抑制肿瘤生长，增加CD8+ T细胞浸润、趋化因子表达及GrzB水平。
- 研究意义
- 研究表明TCS有望成为增强抗肿瘤免疫的天然药物，为进一步的药理学研究提供支持。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
凋亡验证
验证TCS是否诱导HCC细胞凋亡及caspase依赖性
使用TCS（25 μg/mL）处理H22细胞，通过Western blot检测凋亡相关蛋白（caspase-9、caspase-8、caspase-3）及PARP；使用Z-VAD-FMK联合处理。
体内异种移植瘤模型
评估TCS在体内的抗肿瘤效果
在BALB/c小鼠皮下接种H22细胞，建立异种移植瘤模型，不同剂量TCS处理，测量肿瘤体积、重量。
免疫细胞浸润与细胞因子检测
检测TCS对肿瘤组织内CD8+ T细胞浸润及趋化因子/细胞因子表达的影响
通过免疫荧光检测CD8+ T细胞，ELISA检测肿瘤组织和血清中CCL2、CCL22、TNF-α、IFN-γ水平。
GrzB和M6PR表达检测
检测TCS对GrzB和M6PR表达的影响
通过免疫组化、Western blot检测肿瘤组织中GrzB和M6PR表达，TUNEL凋亡检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白提取与纯化 | 重组TCS质粒 | Tsingke Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 蛋白纯化 | AKTA纯化仪 | GE | -- |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| 酶标仪（Epoch） | BioTek | -- | |
| 细胞死亡检测 | 钙黄绿素-AM | MCE | HY-D0041 |
| 碘化丙啶 | MCE | HY-D0815 | |
| 凋亡抑制实验 | Z-VAD-FMK | Beyotime | C1202 |
| 免疫荧光 | DAPI | Solarbio | D8200 |
| TUNEL凋亡检测 | DeadEnd™荧光TUNEL系统 | Beyotime | C1088 |
| 免疫组织化学 | 免疫组织化学试剂盒 | Solarbio | SP0021 |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂盒 | Promega | LS1040 |
| RT-qPCR | Hifair III 第一链cDNA合成SuperMix（含gDNA去除） | Yeasen | 11141ES60 |
| Goldenstar™ RT6 cDNA合成试剂盒 | TSINGKE | TSG302M | |
| ELISA | ELISA MAX™标准套件小鼠MCP-1 | BioLegend | 432701 |
| ELISA MAX™豪华套件小鼠IFNγ | BioLegend | 430804 | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Jianglaibio | JL10484 | |
| 小鼠MDC/CCL22 ELISA试剂盒 | Jianglaibio | JL11125 | |
| 实时荧光定量PCR | Quantstudio™ 7 Flex实时荧光定量PCR系统 | ABI | -- |
| 蛋白质印迹 | ECL Ultra HRP底物 | -- | -- |
| SAGECREATION ChemiMini™成像系统 | SAGECREATION | -- | |
| 统计软件 | SPSS 26.0 | SPSS Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞活力 | H22细胞株（Procell, CL-0341）；接种密度5×10^3/孔；TCS浓度梯度；处理时间24/48/72小时 阅读提示：Materials and Methods: HCC cell viability assay |
| 凋亡抑制实验 | Z-VAD-FMK浓度40 μM；TCS浓度12.5/25/50 μg/mL；处理时间48小时 阅读提示：Materials and Methods: Apoptosis inhibition test assay |
| 体内异种移植瘤模型 | BALB/c小鼠性别、周龄、体重；H22细胞接种量；分组与剂量（0/0.5/1/2 μg/g）；给药时间（第4、6、8、10、12、14、16天） 阅读提示：Materials and Methods: Xenograft tumor model |
| 免疫细胞浸润与细胞因子检测 | TCS剂量；检测指标；肿瘤组织和血清样本处理 阅读提示：Materials and Methods: Immunohistochemistry (IHC), ELISA |
| 蛋白质检测 | 抗体稀释比例；孵育时间；成像系统 阅读提示：Materials and Methods: Western blot assay |