体外验证HBV对NLRP3炎症小体激活的协同作用
检测HBV与不同NLRP3激活剂（nigericin、MSU、imiquimod、ATP）联合处理对巨噬细胞中NLRP3炎症小体激活的影响
使用LPS预处理的BMDMs、PBMCs和THP-1巨噬细胞，加入HBV颗粒和激活剂（nigericin、MSU、imiquimod、ATP），检测IL-1β和caspase-1 p20的切割和释放。
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乙型肝炎病毒介导的钠内流通过与肝内危险信号协同作用促进肝脏炎症
Hepatitis B virus-mediated sodium influx contributes to hepatic inflammation via synergism with intrahepatic danger signals.
实验完整度
高包含体外细胞实验、小鼠模型及患者样本三个证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） 人外周血单个核细胞（PBMCs） THP-1巨噬细胞 HBV转基因小鼠腹腔炎症模型 重度乙型肝炎患者血浆及肝组织
重点核对
HBV暴露时间（24小时）及后续静息时间（24小时）对NLRP3炎症小体激活的影响 细胞外钾浓度（40 mM KCl）对NLRP3激活的抑制作用 P2X7抑制剂（A438079、A740003、suramin）对HBV协同作用的影响 PMA分化THP-1细胞（100 ng/ml PMA 24小时）用于炎症小体测定 MSU诱导的腹膜炎模型（0.75 mg/小鼠腹膜内注射）
摘要
NALT3、LRR和PYD结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体已被涉及多种慢性肝病的发病机制。然而，其在乙型肝炎病毒相关肝炎中的作用仍不清楚。在此，我们证明了HBV与潜在的肝内危险信号对NLRP3炎症小体激活的协同作用。在适当的时间点暴露HBV可增强巨噬细胞中依赖钾外流的NLRP3炎症小体激活，并增加HBV转基因小鼠模型中NLRP3炎症小体介导的炎症。通过相关性分析、共聚焦显微镜和共免疫沉淀观察到HBV与以ATP分子为代表的肝内信号对NLRP3激活的协同作用，其效应细胞因子与严重乙型肝炎患者的肝脏炎症呈正相关。此外，HBV对NLRP3炎症小体激活的协同作用归因于巨噬细胞钠内流增加。我们的数据表明，HBV通过钠内流依赖的NLRP3炎症小体协同激活促进肝脏炎症，这为HBV相关肝炎的免疫发病机制提供了更深入的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HBV是否以及如何通过NLRP3炎症小体促进肝脏炎症？
- 核心机制
- HBV通过增加巨噬细胞钠内流，增强钾外流依赖的NLRP3炎症小体激活，从而放大炎症反应。
- 主要证据
- 体外巨噬细胞实验显示HBV与nigericin、MSU、ATP协同增强IL-1β和caspase-1 p20的产生；HBV转基因小鼠MSU腹膜炎模型中中性粒细胞浸润和IL-1β释放增加；患者血浆中caspase-1 p20与ATP和HBV DNA水平正相关，肝组织中NLRP3与caspase-1共定位。
- 研究意义
- 研究揭示了HBV相关肝炎免疫发病机制的新途径，可能为改善HBV特异性CD8+ T细胞反应提供新的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内验证HBV对NLRP3炎症小体介导炎症的增强作用
评估HBV转基因小鼠中NLRP3炎症小体依赖性炎症反应是否增强
使用MSU诱导的腹膜炎模型，比较HBV转基因小鼠和野生型小鼠腹腔中性粒细胞浸润和IL-1β释放。
患者中NLRP3炎症小体激活与肝损伤的相关性分析
确定HBV相关严重肝炎患者中NLRP3炎症小体是否激活及其与肝损伤指标的关系
检测患者血浆中的caspase-1 p20、IL-1β、IL-18水平，肝组织中的caspase-1活性、NLRP3炎症小体组装，以及进行转录组分析。
探讨HBV协同作用的机制：钠内流的作用
研究HBV是否通过影响巨噬细胞钠离子流动来增强NLRP3炎症小体激活
使用全细胞膜片钳记录THP-1巨噬细胞在HBV暴露下的钠电流，并用钠通道阻滞剂DPH验证其对HBV协同作用的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco Laboratories | -- |
| DMEM培养基 | Gibco Laboratories | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco Laboratories | -- | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | 315-02 | |
| 细胞分化 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | MCE | HY-18739 |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L2654 |
| 尼日利亚霉素 | MCE | HY-100381 | |
| 尿酸单钠晶体 | InvivoGen | tlrl-msu | |
| 三磷酸腺苷 | InvivoGen | tlr1-atp | |
| 咪喹莫特 | MCE | HY-B0180 | |
| 信号通路抑制 | A438079 | MCE | HY-15488 |
| A740003 | MCE | HY-50697 | |
| 苏拉明 | MCE | HY-B0879A | |
| 苯妥英钠 | MCE | HY-B0448A | |
| N-乙酰半胱氨酸 | MCE | HY-134495 | |
| 动物实验 | 尿酸单钠晶体 | InvivoGen | tlrl-msu |
| 检测 | 支原体检测试剂盒 | InvivoGen | rep-mys-10 |
| Caspase-1活性检测试剂盒 | BioVision | K111 | |
| ATP检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | FLAA-1KT | |
| Caspase-1 p20检测试剂盒 | R&D | DCA100 | |
| 人IL-1β ELISA检测试剂盒 | ThermoFisher | BMS224-2 | |
| 人IL-1β ELISA检测试剂盒 | Invitrogen | 88-7261-88 | |
| 小鼠IL-1β ELISA检测试剂盒 | Invitrogen | 88-7013-88 | |
| 人IL-18 ELISA检测试剂盒 | Raybiotech | ELH-IL18 | |
| M30检测试剂盒 | Peviva | M30-Apoptosense | |
| Western blot | 化学发光试剂 | Millipore | 34095 |
| 免疫沉淀 | BS3交联剂 | ThermoFisher Scientific | A39266 |
| Dynabeads蛋白G | Dynal | 10003D | |
| 细胞培养 | 淋巴分离液 | STEM CELL | -- |
| 转染 | 脂质体转染试剂3000 | Invitrogen | -- |
| 抗体 | 抗Caspase-1 p10抗体 | Santa | sc515 |
| 抗Caspase-1 p20抗体 | Cell signaling Technology | 2225 | |
| 抗Caspase-1抗体 | AdipoGen | AG-20B-0042 | |
| 抗P2X7抗体 | Abcam | ab109246 | |
| 抗NLRP3抗体 | Santa | sc134306 | |
| 抗NLRP3抗体 | Sigma-Aldrich | HPA012878 | |
| 抗切割IL-1β抗体 | Cell signaling Technology | 83186 | |
| 抗IL-1β抗体 | Cell signaling Technology | 12426 | |
| 抗IL-1β抗体 | R&D | AF-401-NA | |
| 抗IL-18抗体 | Abcam | ab243091 | |
| 抗切割GSDMD C末端抗体 | Cell signaling Technology | 36425s | |
| 肝细胞抗原1抗体 | Abcam | ab129076 | |
| 抗P2X7抗体 | Cell signaling Technology | 13809 | |
| 抗β肌动蛋白抗体 | Cell signaling Technology | 3700 | |
| 抗Nav1.5抗体 | Proteintech | 23016-1-AP | |
| 抗Nav1.6抗体 | Abcam | ab65166 | |
| 抗Nav1.7抗体 | FineTest | FNab07646 | |
| 流式细胞术 | 抗CD11b PE-cy7抗体 | eBioscience | 25-0112-82 |
| 抗Ly6C FITC抗体 | BioLegend | 128005 | |
| 抗Ly6G PE抗体 | BioLegend | 127607 | |
| 多重免疫荧光 | 抗CD68抗体 | Immunoway | YM3050 |
| 抗CD8抗体 | Affinity | AF5126 | |
| 免疫荧光 | 驴抗兔Ig(H+L) Alexa Fluor 555标记二抗 | Invitrogen | A31572 |
| 驴抗小鼠Ig(H+L) Alexa Fluor 488标记二抗 | Invitrogen | A21202 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外巨噬细胞实验 | LPS浓度（100-1000 ng/ml），刺激时间（3-6小时），nigericin浓度（20 μM），MSU浓度（100-1000 μg/ml），ATP浓度（5 mM），HBV暴露时间（24小时）及静息时间（24小时），细胞外钾浓度（40 mM） 阅读提示：STAR★Methods中'Macrophage culture and stimulation'部分 |
| 体内小鼠模型 | HBV转基因小鼠品系（C57BL/6），年龄（6-8周），性别（雄性），MSU剂量（0.75 mg/小鼠），注射体积（150 μl PBS），观察时间（6小时） 阅读提示：STAR★Methods中'MSU-induced peritonitis model in HBV-tg mouse'部分 |
| 患者样本分析 | 患者分组标准（活动性重型肝炎：HAI≥6或ALT≥200 IU/mL等；轻度肝炎：HAI<6等），血浆/肝组织采集和处理方法，ELISA检测指标（IL-1β、IL-18、caspase-1 p20），caspase-1活性测定，NLRP3炎症小体组装检测 阅读提示：STAR★Methods中'Experimental model and study participant details'和'Investigation of activation and assembly of NLRP3 inflammasome in patients with hepatitis B'部分 |
| 膜片钳记录 | THP-1细胞分化条件（PMA 100 ng/ml 24小时），HBV浓度（100 vp/cell），记录时间（5-10分钟），细胞内液成分（145 mM KCl, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES），电压方案（-60 mV至+60 mV，步进10 mV） 阅读提示：STAR★Methods中'Whole-cell patch-clamp assay for HBV-mediated sodium influx in THP-1 macrophages'部分 |