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        MicroRNA-92b通过靶向I型受体作为TGF-β信号的负调控因子

        MircroRNA-92b as a negative regulator of the TGF-β signaling by targeting the type I receptor.

        作者信息Shu Yang, Kewei Jiang, Lixing Li, Jiaqing Xiang, Yanchun Li, Lin Kang, Guangyan Yang, Zhen Liang
        PMID37867958
        期刊iScience
        发布时间2023-10-05
        DOI10.1016/j.isci.2023.108131
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含体内动物模型（UUO和uIRI）和体外细胞实验（HK2、HRF），并有功能验证（过表达/敲除）和机制验证（靶基因、信号通路）。

        主要模型

        UUO小鼠模型 uIRI小鼠模型 HK2人肾近端小管上皮细胞 HRF人肾成纤维细胞

        重点核对

        miR-92b-3p在纤维化肾组织中的表达验证（qPCR） miR-92b-3p直接靶向TGFBR1的验证（双荧光素酶报告基因） miR-92b-3p对TGF-β/SMAD3信号通路的调控（Western blot） 体内miR-92b过表达和敲除对肾纤维化的影响（AAV介导） TGF-β通过SNAI1/SNAI2抑制miR-92b转录的验证（ChIP）

        摘要

        转化生长因子β1（TGFβ1）已被确定为慢性肾脏病（CKD）发展的主要致病因子。本研究探讨了miR-92b-3p在单侧输尿管梗阻（UUO）和单侧缺血再灌注损伤（uIRI）小鼠模型中肾纤维化进展中的作用，并探讨了其在人肾近端小管上皮（HK2）细胞中的潜在机制。我们发现，miR-92b敲除后UUO小鼠的肾纤维化增加，而在miR-92b过表达小鼠中肾纤维化减少。MiR-92b敲除加剧了uIRI小鼠的肾纤维化。RNA测序分析、荧光素酶报告基因实验、qPCR分析和蛋白质印迹证实，miR-92b-3p直接靶向TGF-β受体1，从而通过抑制TGF-β信号通路减轻肾纤维化。此外，我们发现TGF-β通过Snail家族转录抑制因子1和2抑制miR-92b转录。我们的结果表明，miR-92b-3p可能作为缓解CKD纤维化的新型治疗靶点。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        miR-92b-3p在肾纤维化发生发展中的作用及其潜在机制是什么？
        核心机制
        miR-92b-3p通过直接靶向TGFBR1的3'UTR抑制TGF-β受体1表达，从而抑制TGF-β信号通路，减轻肾纤维化；而TGF-β通过SNAI1和SNAI2转录因子抑制miR-92b的转录，形成负反馈环路。
        主要证据
        UUO和uIRI小鼠模型显示miR-92b敲除加重肾纤维化，过表达减轻肾纤维化；体外HK2细胞中miR-92b mimic抑制SMAD3磷酸化和促纤维化基因表达，而inhibitor增强；双荧光素酶报告实验证实TGFBR1为直接靶点；ChIP实验显示SNAI1和SNAI2结合THBS3-AS1启动子抑制miR-92b转录。
        研究意义
        研究揭示miR-92b-3p在CKD进展中的保护作用，可能作为治疗肾纤维化的新型靶点。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        检测miR-92b-3p在纤维化肾组织中的表达

        确定miR-92b-3p在肾纤维化中的表达变化。

        通过qPCR检测UUO小鼠和DKD患者肾活检样本（GEO数据集）中miR-92b-3p的表达。

        2

        miR-92b敲除和过表达对肾纤维化的影响（体内）

        验证miR-92b对肾纤维化发展的直接影响。

        使用miR-92b敲除小鼠（M92KO）和AAV9介导的肾小管特异性过表达小鼠（M92OE），建立UUO和uIRI模型，通过组织染色、免疫组化、Western blot和qPCR评估纤维化程度。

        3

        体外验证miR-92b-3p对TGF-β信号通路的调控

        研究miR-92b-3p在细胞水平如何影响TGF-β信号通路。

        在HK2细胞中，使用miR-92b mimic或inhibitor处理，结合TGF-β刺激，通过Western blot检测SMAD3磷酸化、下游蛋白表达，核质分离检测SMAD3核转位。

        4

        验证TGFBR1为miR-92b-3p的直接靶基因

        确认miR-92b-3p是否直接靶向TGFBR1。

        通过StarBase预测结合位点，双荧光素酶报告基因实验验证miR-92b-3p与TGFBR1 3'UTR结合，检测miR-92b mimic/inhibitor对TGFBR1表达的影响，并使用siRNA或过表达验证其依赖性。

        5

        体内敲低TGFBR1验证miR-92b靶向的特异性

        验证miR-92b敲除加剧纤维化是否依赖于TGFBR1。

        在UUO模型中，通过AAV9-shTgfbr1敲低TGFBR1，比较WT和M92KO小鼠的纤维化程度。

        6

        揭示TGF-β抑制miR-92b表达的机制

        探究TGF-β如何下调miR-92b-3p表达。

        通过siRNA敲低SNAI1和SNAI2检测miR-92b-3p表达，构建THBS3-AS1启动子截短体荧光素酶报告基因，并通过ChIP验证SNAI1/SNAI2与启动子结合。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        实时荧光定量PCRMasson三色染色天狼星红染色
        验证细胞功能变化
        细胞转染荧光素酶报告基因实验
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹逆转录定量PCR
        验证免疫效应
        免疫荧光染色免疫组织化学
        验证机制链路
        RNA测序创新通路分析TargetScan染色质免疫沉淀
        评估体内效果
        单侧输尿管梗阻模型单侧缺血再灌注损伤模型
        数据分析与统计
        学生t检验单因素方差分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        Western blotβ-肌动蛋白抗体Abcamab8226
        CTGF抗体Abcamab6992
        α-平滑肌肌动蛋白抗体Abcamab7817
        SMAD3抗体Abcamab40854
        组蛋白H3抗体Abcamab1791
        TGFβR1抗体Abcamab235578
        SNAI1抗体Abcamab216347
        SNAI2抗体Abcamab27568
        COL1A1抗体Novussc-293182
        COL3A1抗体Novussc-514601
        E-钙粘蛋白抗体Proteintech20874-1-AP
        磷酸化SMAD3抗体Thermo Fisher Scientific44-246G
        免疫荧光山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488invitrogenA-11008
        细胞培养转化生长因子-β1PeproTech100-21
        蛋白提取蛋白酶抑制剂混合物Roche04693132001
        RNA提取Trizol试剂invitrogen15596-026
        细胞培养人肾近端小管上皮细胞ATCCCRL-2190
        人肾小球内皮细胞ScienCell4000
        人肾系膜细胞ScienCell4200
        人肾成纤维细胞ProcellCP-H072
        人胚肾细胞293TProcellCL-0005
        RNA干扰TGFBR1 siRNASanta Cruz biotechnologysc-40222
        SNAI1 siRNASanta Cruz biotechnologysc-38398
        SNAI2 siRNASanta Cruz biotechnologysc-38393
        对照siRNASanta Cruz biotechnologysc-37007
        组织染色改良天狼星红染色试剂盒Solarbio Life ScienceG1472
        蛋白提取提取试剂盒Solarbio Life ScienceR0010
        蛋白定量快速Gold BCA蛋白定量试剂盒Thermo fisher scientificA53225
        Western blotChemistar™高灵敏度ECL化学发光底物Tanon180-5001
        RNA提取miRNeasy试剂盒Qiagen217061
        cDNA合成通用cDNA合成试剂盒Roche11483188001
        qPCRSYBR Green I主混合物Roche04913914001
        cDNA合成iScript cDNA合成试剂盒Bio-Rad1708890
        免疫组化免疫组化试剂盒ZSGB-BIOPV9001; PV9002; PV9000
        核蛋白提取核蛋白提取试剂盒Thermo Fisher Scientific78833

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        动物模型
        小鼠品系（C57BL/6J或miR-92b-/-），年龄（8周龄），雄性，UUO手术时间点（7天或10天），uIRI缺血时间（45分钟），AAV9注射剂量（miR-92b: 2.37E+13 v.g/ml；shTgfbr1: 6.25E+13 v.g/ml）及注射后等待时间（2周）。
        阅读提示：STAR★Methods - Animal models
        细胞培养与转染
        HK2细胞来源（ATCC），培养条件（MEM培养基，10% FBS），转染试剂（Lipofectamine 3000），miR-92b mimic/inhibitor浓度（未明确说明），siRNA浓度（50 pmol/mL），转染时间（24小时）。
        阅读提示：STAR★Methods - Cell culture and transfection
        体外TGF-β处理
        TGF-β浓度（2 ng/mL），处理时间（24小时），miR-92b mimic或inhibitor预转染时间（24小时）。
        阅读提示：Figure 5C, 5E, 5G, 5H
        双荧光素酶报告基因实验
        报告质粒（TGFBR1 3'UTR-WT/MT），共转染miR-92b mimic的剂量（剂量依赖性），检测时间（转染后24小时）。
        阅读提示：STAR★Methods - Dual-luciferase reporter assay; Figure 6C
        Western blot
        抗体稀释比例（如α-SMA 1:1000，其他见正文），蛋白上样量（未明确说明），封闭条件（未明确说明）。
        阅读提示：STAR★Methods - Protein extraction and western blot analysis; Key resources table
        ChIP实验
        抗体（anti-SNAI1, anti-SNAI2），免疫沉淀的DNA区域（-2224到-2113 bp和-2016到-1852 bp），检测方法（qPCR）。
        阅读提示：Figure 8H; STAR★Methods - Prediction of transcription factors

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