生物信息学筛选与模型构建
识别与HBV-HCC预后相关的免疫基因，构建预后风险模型并筛选关键基因。
使用TCGA数据库的44例HBV-HCC样本，通过WGCNA、LASSO Cox回归构建六基因预后模型，并通过KM生存曲线和ROC曲线验证。差异分析筛选出AC099850.3作为关键基因。
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AC099850.3通过调控CD276促进HBV-HCC细胞增殖和侵袭：索拉非尼与免疫检查点联合治疗的新策略
AC099850.3 promotes HBV-HCC cell proliferation and invasion through regulating CD276: a novel strategy for sorafenib and immune checkpoint combination therapy.
实验完整度
高包含TCGA生物信息学分析、体外细胞功能验证（CCK-8、Transwell等）、动物皮下移植瘤及原位瘤模型等多个独立证据层级，并进行了机制恢复实验。
主要模型
HepG2.2.15细胞 HBV-HCC皮下移植瘤裸鼠模型 HBV-HCC原位瘤NOD-SCID小鼠模型 TCGA HBV-HCC患者队列
重点核对
HepG2.2.15细胞培养条件（MEM+10%FBS+380μg/mL G418+1%P/S） siRNA序列及转染效率（AC099850.3-siRNA2和CD276-siRNA2） 皮下移植瘤模型：C57BL/6N裸鼠，5×10^6细胞皮下注射，3周后检测 原位瘤模型：NOD-SCID小鼠，1×10^6细胞肝内注射，siRNA剂量2.5mg/kg，SF剂量10mg/kg CC@AC&SF@PP NPs的pH响应释放特性（pH6.5释药率88-94%）
摘要
背景：本研究探讨了负载AC099850.3 siRNA和索拉非尼（SF）的CC@AC&SF@PP纳米颗粒改善乙型肝炎病毒相关肝细胞癌（HBV-HCC）的分子机制。方法：从TCGA数据库中选择44例HBV-HCC患者及其生存信息的数据集。使用ImmPort数据库和WGCNA分析鉴定与生存状态相关的免疫基因。使用Lasso回归构建预后风险模型并进行评估。通过差异分析筛选关键基因，并使用Kaplan–Meier生存曲线、ROC分析、CIBERSORT分析和相关性分析验证其对HBV-HCC的显著性和预测准确性。计算AC099850.3与基因表达矩阵的相关性，随后使用AC099850.3及其共表达基因进行GO和KEGG富集分析。选择HepG2.2.15细胞进行体外验证，并进行慢病毒干扰、细胞周期测定、CCK-8实验、集落形成实验、Transwell实验、划痕实验和流式细胞术以研究关键基因对HepG2.2.15细胞的影响。构建小鼠皮下移植瘤模型以验证关键基因对HBV-HCC肿瘤的抑制作用。随后，制备了pH触发的药物释放NPs（CC@AC&SF@PP），并研究了其对HBV-HCC原位荷瘤小鼠的治疗效果。结果：通过生物信息学分析构建了预后风险模型（AC012313.9、MIR210HG、AC099850.3、AL645933.2、C6orf223、GDF10），在诊断预测中显示出良好的敏感性和特异性。AC099850.3被确定为关键基因，富集分析显示其对细胞周期通路的影响。体外细胞实验表明，AC099850.3通过调节免疫检查点CD276的表达和细胞周期进程促进HepG2.2.15细胞增殖和侵袭。在体内，皮下移植瘤实验表明AC099850.3促进裸鼠HBV-HCC肿瘤的生长。此外，成功制备了负载AC099850.3 siRNA和SF的pH触发药物释放NPs（CC@AC&SF@PP），并将其递送至原位HBV-HCC，增强了HBV-HCC联合治疗的效果。结论：AC099850.3通过上调免疫检查点CD276的表达加速细胞周期进程，促进HBV-HCC的发生和发展。负载AC099850.3 siRNA和SF的CC@AC&SF@PP NPs提高了HBV-HCC联合治疗的效果。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AC099850.3在HBV-HCC中的功能及其调控CD276的机制，以及负载AC099850.3 siRNA和索拉非尼的pH响应纳米粒的联合治疗效果。
- 核心机制
- AC099850.3通过上调免疫检查点CD276的表达，加速细胞周期进程，从而促进HBV-HCC细胞的增殖和侵袭。
- 主要证据
- 生物信息学分析显示AC099850.3与CD276正相关；体外实验敲低AC099850.3或CD276导致G2/M期阻滞、增殖和侵袭能力下降，而回补CD276可逆转；体内实验敲低AC099850.3抑制肿瘤生长，过表达CD276则恢复。
- 研究意义
- 本研究为HBV-HCC提供了新的预后标志物和治疗靶点，并展示了CC@AC&SF@PP纳米粒联合基因治疗和化疗的潜力，为临床转化提供了参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
AC099850.3功能富集分析
探索AC099850.3及其共表达基因在HBV-HCC中的潜在功能通路。
通过相关性分析（R>0.7, P<0.001）获得727个共表达基因，进行GO和KEGG富集分析。
体外细胞实验验证AC099850.3/CD276功能
验证AC099850.3通过CD276调节HepG2.2.15细胞增殖、侵袭和细胞周期。
使用siRNA敲低AC099850.3或CD276，并通过过表达CD276进行回补实验，检测细胞周期、增殖、凋亡、迁移和侵袭能力。
皮下移植瘤模型验证体内作用
在体内验证AC099850.3/CD276对HBV-HCC肿瘤生长的影响。
将不同处理的HepG2.2.15细胞注射到裸鼠皮下，3周后取瘤称重，检测相关蛋白和凋亡。
CC@AC&SF@PP纳米粒的制备与表征
制备并表征pH响应共递送AC099850.3 siRNA和SF的纳米粒，评估其药物释放特性。
通过单乳液法制备SF@PP NPs，静电吸附siRNA，CMCS包覆得到CC@AC&SF@PP，并通过TEM、DLS、Zeta电位、UV-Vis、HPLC等表征。
原位瘤模型评估联合治疗效果
评估CC@AC&SF@PP NPs在原位HBV-HCC肿瘤模型中的靶向递送和抗肿瘤效果。
建立原位瘤模型，分6组给药，通过生物发光成像监测肿瘤生长，并通过RT-qPCR、Western blot、IHC、HE、TUNEL评估效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MEM培养基 | Procell | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 遗传霉素 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| HepG2/2.2.15专用培养基 | Procell | CM-0594 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | ThermoFisher | 11668-019 |
| Opti-MEM培养基 | ThermoFisher | 31985070 | |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | MCE | HY-D0815 |
| 核糖核酸酶 | -- | -- | |
| CCK-8 assay | CCK-8试剂 | Apexbio | K1018 |
| 克隆形成实验 | 吉姆萨染液 | Beyotime | C0131 |
| Transwell实验 | 基质胶 | BD Biosciences | 354234 |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC凋亡染色/检测试剂盒 | Abcam | ab14085 |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Sigma | BCA1-1KT |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| 抗CD276抗体 | Abcam | ab105922 | |
| 山羊抗兔HRP二抗 | Abcam | ab6721 | |
| 免疫组化 | 抗CD276抗体 | Abcam | ab219648 |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Abcam | ab6721 | |
| 链霉亲和素-生物素复合物 | Solarbio | SA0041 | |
| DAB显色试剂 | Solarbio | DA1010 | |
| RT-qPCR | 组织RNA提取试剂盒 | ThermoFisher | 12183018A |
| 细胞RNA提取试剂盒 | ThermoFisher | 12183020 | |
| 第一链cDNA合成试剂盒 | Fermentas | K1622 | |
| Fast SYBR Green PCR试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| ABI PRISM 7500实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 药物 | 索拉非尼 | MCE | HY-10201 |
| 纳米粒制备 | mPEG5K-PAE10K聚合物 | 西安齐岳生物科技有限公司 | Q-0265422 |
| 羧甲基壳聚糖 | Solarbio | C9400 | |
| 氯仿 | 国药集团 | -- | |
| 甲醇 | 国药集团 | -- | |
| 动物实验 | D-荧光素钾盐 | MCE | HY-12591B |
| 纳米粒制备 | DEPC水 | MCE | HY-156262 |
| Amicon Ultra-15超滤管 | Sigma | UFC900324 | |
| 针头式过滤器 | Millipore | -- | |
| 纳米粒表征 | 醋酸铀 | -- | -- |
| JEM-2100F透射电子显微镜 | JEOL | -- | |
| 紫外-可见分光光度计 | 中国AOE仪器 | -- | |
| Zetasizer Nano ZS90粒径分析仪 | Malvern | -- | |
| 药物释放研究 | 透析袋（14 kDa MWCO） | 上海茂康生物科技有限公司 | MP1719-5 M |
| 细胞摄取实验 | Cy3标记的AC099850.3 siRNA | -- | -- |
| 体内成像 | Cy5标记的AC099850.3 siRNA | -- | -- |
| IVIS Lumina XRMS小动物活体成像系统 | PerkinElmer | CLS136340 | |
| 组织切片 | OCT包埋剂 | -- | -- |
| Hoechst 33342核染料 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 伊红 | 国药集团 | 71014544 |
| 乙醇 | 国药集团 | 10009218 | |
| 二甲苯 | 国药集团 | 10023418 | |
| 中性树胶 | 国药集团 | 10004160 | |
| TUNEL检测 | 细胞凋亡检测试剂盒 | Solarbio | T2190 |
| DAPI染色液 | Beyotime | C1002 | |
| 组织蛋白提取 | 组织蛋白提取试剂盒 | Solarbio | EX2171 |
| 细胞蛋白提取 | 细胞蛋白提取试剂盒 | Solarbio | EX2170 |
| Western blot | PVDF膜 | EMD Millipore | -- |
| 增强化学发光系统 | ThermoFisher | iBright FL1500 | |
| 划痕实验 | 无菌移液枪头 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HepG2.2.15细胞培养基成分（MEM+10%FBS+380μg/mL G418+1%P/S）及培养条件 阅读提示：Methods - In vitro cell culture |
| 细胞转染 | 转染试剂（Lipofectamine 2000）用量、siRNA序列及浓度（50ng/mL质粒）、转染时间 阅读提示：Methods - Cell treatment and grouping |
| 细胞周期分析 | PI染色浓度（50μg/mL）、RNase浓度（10μg/mL）、染色时间 阅读提示：Methods - Cell cycle analysis |
| 皮下移植瘤模型 | 小鼠品系、周龄、体重，细胞注射量（5×10^6/0.2mL），肿瘤测量时间（3周） 阅读提示：Methods - Subcutaneous transplanted tumor experiment in mice |
| 原位瘤模型 | 小鼠品系（NOD-SCID）、细胞注射量（1×10^6），给药剂量（siRNA 2.5mg/kg，SF 10mg/kg），给药时间（第1,4,7,10,13天） 阅读提示：Methods - HBV-HCC in situ tumor model |
| 纳米粒制备 | SF@PP NPs制备参数（单乳液法、超声功率275W、时间4min）及siRNA/SF/CMCS质量比（40:4:1:1） 阅读提示：Methods - Preparation of SF@PP NPs, AC&SF@PP NPs, CC@AC&SF@PP NPs |
| 药物释放 | pH值（6.5和7.4）、温度37℃、转速150rpm、取样时间点 阅读提示：Methods - In vitro drug release study |