抗体诱导细胞间融合的初步观察
验证RBM抗体能否在缺乏ACE2的情况下诱导表达刺突蛋白的细胞之间发生融合。
将共表达刺突蛋白和Cre的HEK293T细胞与表达Stop-Luc的细胞共培养，加入不同中和抗体（CB6, FD20, REGN10933, REGN10987）后检测荧光素酶活性。在A549细胞中通过免疫荧光观察合胞体形成。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
抗体介导的刺突蛋白激活促进SARS-CoV-2的细胞间传播
Antibody-mediated spike activation promotes cell-cell transmission of SARS-CoV-2.
实验完整度
高包含体外细胞融合模型、抗体诱导蛋白水解、机制验证（S1/S2切割）及活病毒感染实验，多层次功能验证。
主要模型
HEK293T细胞（ACE2低表达，用于细胞-细胞融合实验） A549细胞（人肺癌上皮细胞，用于合胞体形成实验） Vero E6细胞（用于活SARS-CoV-2感染实验） SARS-CoV-2刺突蛋白变异株（Alpha、Beta、Delta、Omicron BA.1和BA.4）
重点核对
抗体种类及浓度（如CB6、REGN10933等，12.5 nM） S1/S2切割位点完整性（WT vs R685A及ΔRRAR突变体） S1脱落和S2'切割检测（Western blot） 细胞融合模型（Cre-loxP荧光素酶报告基因系统） 活病毒感染实验MOI 2和抗体处理时间（48小时）
摘要
由新兴的SARS-CoV-2关注变种驱动的COVID大流行仍然是一个主要的全球健康问题，并且不断出现的突变对当前的治疗方法构成挑战。刺突糖蛋白不仅对于初始病毒进入至关重要，而且通过合胞体形成也负责SARS-CoV-2成分的传播。刺突介导的细胞间传播对细胞外治疗性和恢复期抗体具有强抗性，其机制未知。在这里，我们描述了抗体介导的刺突蛋白激活和在展示病毒刺突蛋白的细胞上形成合胞体。我们发现，针对受体结合基序（RBM）的可溶性抗体能够诱导刺突蛋白在S1/S2和S2'切割位点的蛋白水解加工，从而触发不依赖ACE2的细胞间融合。机制上，抗体诱导的细胞间融合需要S1脱落和融合肽在细胞表面的暴露。通过抑制S1/S2蛋白水解，我们证明刺突介导的细胞间融合可以在体外重新对抗体中和敏感。最后，我们证明由真实SARS-CoV-2感染介导的细胞病变效应不受细胞外中和抗体添加的影响。因此，这些结果揭示了一种新型的抗体逃逸模式，并为靶向SARS-CoV-2感染细胞的抗体选择和药物设计策略提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 可溶性RBM抗体是否及如何介导刺突蛋白激活并促进细胞间传播，从而抵抗抗体中和？
- 核心机制
- RBM抗体结合诱导刺突蛋白S1亚基脱落，暴露融合肽，在S1/S2位点切割存在时触发ACE2非依赖性细胞间融合；若S1/S2未切割，则抗体结合导致刺突蛋白内化，抑制融合。
- 主要证据
- 在HEK293T和A549细胞中，CB6和REGN10933等RBM抗体诱导了合胞体形成和S1脱落、S2'切割；R685A突变或furin抑制则消除或减弱此效应；活病毒实验显示CB6增强S2'切割和N蛋白表达。
- 研究意义
- 揭示了RBM抗体介导的刺突蛋白激活作为免疫逃逸的新机制，为靶向S1/S2切割位点和S1脱落的治疗策略提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证抗体诱导的S1脱落和S2'切割
探究抗体诱导的细胞融合是否依赖于刺突蛋白的蛋白水解过程。
通过免疫印迹检测抗体处理后细胞上清中脱落S1亚基和细胞裂解物中S2'切割产物。使用不同抗体浓度（0.1-12.5 nM）进行剂量响应分析。用蛋白酶K处理验证S2'产物的抗性。
验证S1/S2切割的必要性
确定S1/S2位点的切割是否对抗体诱导的细胞融合和S1脱落是必需的。
比较表达WT刺突蛋白和R685A突变体（缺乏furin切割位点）的细胞在CB6抗体处理下的融合和S1脱落情况。使用furin抑制剂RVKR和siRNA敲降furin，以及furin过表达，验证furin介导的切割在过程中的作用。
验证中和抗体的差异效应
评估在细胞-细胞融合和假病毒颗粒中和中，S1/S2切割对抗体中和效率的影响。
比较CB6对WT和R685A刺突蛋白假病毒颗粒感染和细胞融合的中和能力。检测在不同条件下（有无furin抑制剂）的融合抑制率。
验证蛋白酶介导的S1/S2切割促进抗体逃逸
探讨外源性蛋白酶是否能恢复R685A突变体的抗体诱导细胞融合并促进抗体逃逸。
在表达R685A或ΔRRAR刺突蛋白的细胞中加入外源性TPCK-胰蛋白酶，观察是否恢复CB6诱导的S1脱落和细胞融合，以及对CB6中和敏感性的影响。
活病毒感染的验证
在活SARS-CoV-2感染背景下验证CB6抗体对刺突蛋白激活和细胞间传播的促进作用。
用2 MOI活病毒（Wuhan-Hu-1）感染Vero E6细胞，随后加入不同浓度的CB6抗体，观察细胞病变效应、病毒滴度和刺突蛋白切割。在存在或不存在抗ACE2阻断抗体的情况下检测细胞病变和病毒蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞-细胞融合检测
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Sigma | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | -- | |
| MEM培养基 | Procell | -- | |
| 抗体纯化 | Expi293细胞 | Thermo Fisher | A14527 |
| 蛋白A琼脂糖珠 | -- | -- | |
| 脱盐柱 | Biorad | -- | |
| 试剂和质粒 | TPCK处理的胰蛋白酶 | Thermo Fisher | PI20233 |
| Dec-RVKR-cmk（弗林蛋白酶抑制剂） | MedChemExpress | HY-107760 | |
| 巴弗洛霉素A1 | MedChemExpress | HY-100558 | |
| ACE2多克隆抗体 | Proteintech | 21115-1-AP | |
| 兔抗SARS-CoV-2 S2抗体 | Sino Biological | 40590-T62 | |
| 小鼠抗SARS-CoV-2 N抗体 | Sino Biological | 40143-MM05 | |
| 小鼠抗S1抗体 | Sino Biological | 40591-MM42 | |
| Omicron特异性抗S1抗体 | Sino Biological | 40592-MM117 | |
| 兔抗PARP抗体 | CST | 9532S | |
| 抗EEA1抗体 | CST | 3288S | |
| 兔抗LAMP1抗体 | CST | 9091S | |
| 兔抗人弗林蛋白酶多克隆抗体 | Proteintech | 18413-1-AP | |
| 小鼠抗人ACE2阻断单克隆抗体 | Sino Biological | 10108-MM37 | |
| 免疫印迹 | 小鼠抗β-微管蛋白抗体 | Abclonal | AC030 |
| HRP标记的山羊抗小鼠二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| HRP标记的山羊抗人Fc二抗 | Sigma | A0171 | |
| 免疫染色 | 山羊抗人IgG (H+L)-555 | Invitrogen | A48277 |
| 山羊抗兔IgG (H+L)-488 | Invitrogen | A11034 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L)-488 | Invitrogen | A11029 | |
| 质粒构建 | pVAX1载体 | -- | -- |
| KOD PLUS DNA聚合酶 | TOYOBO | -- | |
| Dpn I限制酶 | -- | -- | |
| XL10-Gold超级感受态大肠杆菌 | Agilent | -- | |
| Nanodrop分光光度计 | Thermo | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | -- |
| 细胞融合检测 | Steady-Glo荧光素酶底物 | Promega | E2520 |
| Synergy H1酶标仪 | Biotek | -- | |
| CellTiter-Lumi Steady细胞活力检测试剂 | Beyotime | -- | |
| 显微镜观察 | IX73倒置显微镜 | Olympus | -- |
| 免疫沉淀 | Protein A/G磁珠 | Bimake | B23202 |
| 免疫印迹 | PVDF膜 | Millipore | -- |
| PicoLight化学发光底物 | Epizyme Scientific | -- | |
| 5200化学发光成像系统 | Tanon | -- | |
| 细胞处理 | 蛋白酶K | Invitrogen | AM2548 |
| RNA干扰 | siRNA（靶向弗林蛋白酶） | GenePharma | -- |
| 免疫染色 | Vectashield抗荧光淬灭封片剂 | Vectorlabs | -- |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚） | -- | -- | |
| 共聚焦显微镜 | SpinSR10共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| CRISPR-Cas9 | LentiCRISPR v2载体 | Addgene | #52961 |
| 嘌呤霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞-细胞融合实验 | 细胞类型（HEK293T或A549），抗体种类和浓度（如CB6 12.5 nM），共培养时间（16小时），荧光素酶或mCherry报告系统的构建 阅读提示：Methods: Cell culture, Transient transfection and cell-cell fusion assays |
| 抗体诱导的蛋白水解实验 | 抗体处理浓度和时间（16小时），S1脱落和S2'切割的检测方法（Western blot），蛋白酶K处理条件（10 μg/mL，30 min） 阅读提示：Results section 'Antibody-induced cell-cell fusion requires spike proteolysis at the S1/S2 junction' and Methods: Immunoblotting |
| S1/S2切割位点突变实验 | 刺突蛋白突变体（WT, R685A, ΔRRAR）构建和表达，furin抑制剂（25 μM RVKR）或siRNA处理的条件，furin过表达载体 阅读提示：Methods: Reagents and plasmids, Transient transfection, RNA interference |
| 中和抗体差异实验 | 假病毒颗粒中和实验（CB6浓度、预孵育时间1小时、感染时间6小时、总48小时），细胞融合中和实验（预孵育1小时、共培养6小时），RLU检测 阅读提示：Methods: Antibody neutralization assays |
| 活病毒感染实验 | Vero E6细胞类型（WT或TMPRSS2过表达），MOI为2，感染时间4小时，CB6浓度（12.5或25 nM），抗ACE2抗体（1 μg/mL），观察时间（48小时），TCID50测定方法 阅读提示：Methods: Cell infection with authentic SARS-CoV-2 virus |