验证RNF144A与STING相互作用
确定RNF144A是否与STING直接相互作用，并定位互作结构域。
通过共免疫沉淀（Co-IP）检测外源及内源性RNF144A与STING的相互作用；使用全长和截短突变体确定互作区域；通过原位PLA和共聚焦显微镜验证细胞内共定位。
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RNF144A通过调节STING泛素化促进抗病毒应答
RNF144A promotes antiviral responses by modulating STING ubiquitination.
实验完整度
高研究包含细胞水平（THP1、HaCaT、MEF、BMDM、PM）、动物模型（Rnf144a敲除小鼠HSV-1感染）以及体外泛素化实验，并进行功能验证（过表达/敲低/敲除）和机制验证（K6泛素化位点K236及STING转位）。
主要模型
HEK293T细胞 PMA-THP1细胞（人巨噬细胞样细胞系） HaCaT角质形成细胞 小鼠原代细胞（BMDM、PM、MEF） Rnf144a基因敲除小鼠（HSV-1感染模型）
重点核对
HSV-1感染与否（MOI=1）及刺激时间 RNF144A的表达或敲低/敲除状态（siRNA A2/A3，CRISPR） STING K236位点的突变（K236R） BFA处理（5 μg/ml）以抑制STING转位
摘要
干扰素刺激因子（STING，又称MITA、ERIS、MPYS或TMEM173）在DNA病毒或胞质DNA触发的先天免疫应答中发挥重要作用。在此，我们证明环指间环（RBR）E3泛素连接酶家族成员环指蛋白（RNF）144A与STING相互作用并促进其在K236位点的K6连接泛素化，从而增强STING从内质网向高尔基体的转位及下游信号通路。STING的K236R突变体在促进先天免疫信号转导方面表现出降低的活性。RNF144A的过表达上调HSV-1或胞质DNA诱导的免疫应答，而RNF144A表达的敲低则具有相反效应。此外，Rnf144a缺陷细胞表现出受损的DNA病毒或胞质DNA触发的信号转导，且RNF144A保护小鼠免受DNA病毒感染。相反，RNF144A不影响RNA病毒或胞质RNA触发的先天免疫应答。综上所述，我们的发现鉴定了一个新的DNA病毒或胞质DNA触发信号通路的正调控因子，以及一个对STING在抗病毒应答中完全功能至关重要的关键泛素化位点。关键词：抗病毒先天免疫应答，DNA病毒，翻译后修饰，信号转导，泛素化。主题类别：免疫学，翻译后修饰与蛋白水解，信号转导。RBR家族E3泛素连接酶RNF144A促进DNA病毒或胞质DNA触发的信号转导。RNF144A与STING相互作用并增加其K6连接泛素化，从而增强STING从内质网到高尔基体的转位。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RNF144A在DNA病毒或胞质DNA触发的先天免疫应答中的功能及机制，特别是其作为E3连接酶对STING的调控作用。
- 核心机制
- RNF144A与STING相互作用，促进STING在K236位点的K6连接泛素化，从而增强STING从内质网向高尔基体的转位，进而促进下游TBK1-IRF3信号通路及抗病毒基因表达。
- 主要证据
- RNF144A与STING的相互作用（共免疫沉淀、原位PLA）；泛素化实验显示RNF144A主要促进K6连接泛素化且需要完整的RING结构域；K236R突变降低STING的功能和信号转导；Rnf144a缺失细胞和动物中HSV-1诱导的免疫应答受损。
- 研究意义
- RNF144A作为STING介导的抗病毒先天免疫应答的新正调控因子，可能成为系统性红斑狼疮等自身免疫疾病治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析RNF144A对STING泛素化的影响
检验RNF144A是否作为E3连接酶促进STING泛素化，并鉴定泛素连接类型和位点。
在HEK293T细胞中共转染RNF144A、STING和泛素，通过Co-IP检测泛素化水平；使用泛素突变体（K6、K11等）确定连接类型；构建STING赖氨酸突变体确定泛素化位点；进行体外泛素化实验验证RNF144A的直接作用。
测试RNF144A对STING转位、二聚化和复合物形成的影响
阐明RNF144A介导的泛素化如何调控STING的活化过程。
通过免疫荧光检测STING与内质网（calnexin）、ERGIC（P58）、高尔基体（GM130）的共定位；用native PAGE和SDD-AGE检测STING二聚化和聚集；用Co-IP检测STING与TBK1和IRF3的复合物形成。
评估RNF144A对细胞抗病毒应答的影响
确认RNF144A在DNA病毒或DNA类似物刺激下对抗病毒基因表达和信号通路的影响。
通过real-time PCR检测IFNB、CXCL10等基因表达；通过ELISA检测IFN-β、TNF-α等细胞因子分泌；通过免疫印迹检测STING、TBK1、IRF3、p65的磷酸化及IRF3二聚化。
验证RNF144A在小鼠模型中对DNA病毒感染的保护作用
评估RNF144A在体内对HSV-1感染和抗病毒免疫应答的作用。
使用Rnf144a基因敲除小鼠和野生型小鼠，通过静脉或鼻内感染HSV-1，监测体重、存活率、器官病理、病毒载量及细胞因子表达。
探索RNF144A在系统性红斑狼疮患者中的表达
探究RNF144A是否在自身免疫疾病SLE中失调。
分析两个SLE队列的基因表达数据（GSE37356和GSE45291），并分离SLE患者和健康供者的PBMC，检测RNF144A表达及敲低后对IFN信号的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
泛素化分析
细胞功能实验
动物实验
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞分化 | 佛波酯 | Beyotime Biotechnology | S1819 |
| 药物处理 | C-176 | Selleck | S6575 |
| 核酸刺激 | poly(dA:dT) | InvivoGen | tlrl-patn |
| HSV60 | InvivoGen | tlrl-hsv60n | |
| cGAMP | InvivoGen | tlrl-nacga23 | |
| poly(I:C) | InvivoGen | tlrl-picw | |
| 鲱鱼精DNA | Sigma | D6898 | |
| 转染 | 脂质体2000 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 实时定量PCR | SYBR Green qPCR预混液 | -- | -- |
| 7500 Fast实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| ELISA | IFN-β ELISA试剂盒 | Proteintech | KE00187 |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-7346-88 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-7323-88 | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-7064-88 | |
| 免疫印迹 | 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 |
| 抗HA抗体 | Biolend | 901515 | |
| 抗Myc抗体 | Proteintech | 66004-1-Ig | |
| 抗IFI16抗体 | Santa Cruz | sc-8023 | |
| 抗cGAS抗体 | Proteintech | 26416-1-AP | |
| 抗STING抗体 | Proteintech | 19851-1-AP | |
| 抗磷酸化TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 5483T | |
| 抗TBK1抗体 | Flarbio | CSB-PA024154LA01HU | |
| 抗磷酸化IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4947 | |
| 抗IRF3抗体 | Proteintech | 11312-1-AP | |
| 抗磷酸化p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗p65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| 抗RNF144A抗体 | Proteintech | 26144-1-AP | |
| 抗RNF144A抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-393432 | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8017 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 10068-1-AP | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Flarbio | CSB-PA010109LA01HU | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 60008-1 | |
| 细胞分离 | Ficoll-paque分离液 | GE | 17144002 |
| 共聚焦显微镜 | Nikon A1R共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与分化 | THP1细胞需用100 ng/ml PMA预处理24小时；细胞培养基、血清和抗生素浓度 阅读提示：材料与方法-细胞培养、转染和刺激 |
| 病毒感染 | HSV-1（KOS株）感染复数（MOI）为1，感染时间1.5小时 阅读提示：材料与方法-病毒和感染 |
| 刺激物浓度 | HSV60、HT DNA、poly(dA:dT)、cGAMP的浓度均为1 μg/ml，poly(I:C)为2.5 μg/ml 阅读提示：图例和图EV1、图3 |
| RNF144A敲低 | siRNA序列（A1、A2、A3）及转染试剂（Lipofectamine 2000） 阅读提示：材料与方法-RNA干扰 |
| RNF144A敲除 | CRISPR/Cas9产生的Rnf144a缺失小鼠或THP1细胞，及验证敲除效果 阅读提示：材料与方法-小鼠、图EV1 |
| 泛素化实验 | 泛素突变体（K6、K11等）的使用，STING K236R突变体，RNF144A突变体（C20/23A、C198A），体外泛素化反应体系 阅读提示：图6和图EV5 |
| STING转位检测 | BFA处理（5 μg/ml）抑制STING转位；通过共定位分析（calnexin、P58、GM130）判断 阅读提示：图7和图EV5H |
| 小鼠感染模型 | HSV-1感染剂量（1×10^7或2×10^7 PFU）、感染途径（静脉、鼻内）、小鼠周龄和性别匹配 阅读提示：方法-小鼠、图2 |
| SLE患者样本 | SLE患者PBMC的分离方法，数据集GSE37356和GSE45291的样本量 阅读提示：结果和附录图S2 |