验证MafG在肝纤维化中表达上调
检测MafG在人肝纤维化样本和小鼠肝纤维化模型中的表达水平。
通过免疫组化、Western blot和免疫荧光检测人正常和纤维化肝组织、CCL4和BDL小鼠模型肝组织以及细胞系中MafG的表达，并与α-SMA共定位。
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MafG/MYH9-LCN2轴通过抑制肝星状细胞铁死亡促进肝纤维化
MafG/MYH9-LCN2 axis promotes liver fibrosis through inhibiting ferroptosis of hepatic stellate cells.
实验完整度
高包含体外细胞系和原代细胞实验、体内BDL和CCL4小鼠模型、患者样本分析，以及机制验证（ChIP、EMSA、荧光素酶报告基因、Co-IP、质谱）和功能验证（铁死亡指标检测）。
主要模型
人肝星状细胞系LX-2 大鼠肝星状细胞系HSC-T6 小鼠BDL和CCL4诱导的肝纤维化模型 人肝纤维化/肝硬化活检样本
重点核对
MafG敲低和过表达对HSC铁死亡的影响 MafG与MYH9的相互作用 MafG对LCN2启动子的转录调控 LCN2在MafG调控铁死亡中的作用 AAV6-shMafG和IKE在BDL小鼠模型中的体内效果
摘要
肝星状细胞（HSCs）分泌细胞外基质导致胶原沉积，促成肝纤维化。铁死亡是一种由铁过载依赖性脂质过氧化诱导的新型程序性细胞死亡。调控肝星状细胞中的铁死亡可能对肝纤维化具有治疗潜力。在此，我们发现Maf bZIP转录因子G（MafG）在人和小鼠肝纤维化中上调。有趣的是，MafG敲低增加了HSCs的铁死亡，而MafG过表达赋予HSCs对铁死亡的抗性。机制上，MafG与非肌球蛋白重链IIa（MYH9）物理相互作用，转录激活脂质运载蛋白2（LCN2）的表达，LCN2是已知的铁死亡抑制因子。MARE基序的定点突变阻断了MafG与LCN2启动子的结合。在MafG敲低的HSCs中重新表达LCN2恢复了对铁死亡的抗性。在胆管结扎（BDL）诱导的小鼠模型中，我们发现erastin治疗通过诱导HSC铁死亡减轻了小鼠肝纤维化。基于腺相关病毒6（AAV-6）的HSC特异性敲低MafG增强了erastin诱导的HSC铁死亡和肝纤维化的缓解。总之，MafG通过转录激活LCN2表达抑制HSCs铁死亡从而促进肝纤维化。这些结果表明MafG/MYH9-LCN2信号通路可能成为治疗肝纤维化的新靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MafG是否通过调控肝星状细胞铁死亡参与肝纤维化，其分子机制是什么？
- 核心机制
- MafG与MYH9相互作用，转录激活LCN2表达，LCN2抑制铁死亡，从而促进肝纤维化。
- 主要证据
- 人肝纤维化样本和小鼠肝纤维化模型中MafG表达上调；MafG敲低增加铁死亡，过表达抑制铁死亡；MafG与MYH9结合并直接结合LCN2启动子；AAV6介导的MafG敲低增强IKE诱导的铁死亡并减轻肝纤维化；LCN2回补逆转MafG敲低效应。
- 研究意义
- 揭示MafG/MYH9-LCN2信号通路可作为肝纤维化治疗的新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证MafG调控HSC铁死亡
探索MafG是否参与HSC的铁死亡调控。
使用erastin处理HSC，观察MafG表达变化；敲低或过表达MafG后检测铁死亡指标（铁、MDA、GSH、脂质ROS、细胞活力、线粒体形态）。
鉴定MafG调控铁死亡的靶基因LCN2
确定MafG调控HSC铁死亡的下游靶基因。
利用ChIP-seq数据GSE92076和PCR筛选MafG靶基因，验证MafG对LCN2的转录调控，并通过ChIP、EMSA、荧光素酶报告基因实验确认MafG直接结合LCN2启动子。
验证LCN2在MafG调控铁死亡中的作用
研究LCN2是否介导MafG对HSC铁死亡的调控。
在MafG敲低的LX-2细胞中回补LCN2，检测铁死亡指标和纤维化标志物。
探究MafG的相互作用蛋白MYH9
寻找MafG转录激活LCN2所需的协同因子。
通过质谱鉴定MafG相互作用蛋白，分析其与LCN2表达相关性，并通过Co-IP、免疫荧光验证MafG与MYH9的相互作用，并通过ChIP检测MYH9敲低对MafG结合LCN2启动子的影响。
体内验证MafG敲低增强IKE诱导的HSC铁死亡并减轻肝纤维化
评估靶向MafG在体内对铁死亡和肝纤维化的影响。
使用AAV6-shMafG在小鼠肝星状细胞中敲低MafG，结合IKE治疗，检测肝纤维化标志物、铁死亡指标和肝功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | AAV6-shControl | Hanbio biotechnology | -- |
| AAV6-shMafG | Hanbio biotechnology | -- | |
| 橄榄油 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | Erastin | Selleck Chemicals | S7242 |
| IKE | Selleck Chemicals | S8877 | |
| Ferrostatin-1 | Selleck Chemicals | S7243 | |
| Z-VAD-FMK | Selleck Chemicals | S7023 | |
| ML385 | Selleck Chemicals | S8790 | |
| 星形孢菌素 | Selleck Chemicals | S1421 | |
| 雷帕霉素 | Selleck Chemicals | S1039 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965092 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10100147C | |
| 抗生素 | Gibco | 15070063 | |
| 链霉蛋白酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus | 101000027 |
| RNA提取和PCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| HiScript III逆转录预混液 | Vazyme | -- | |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| SDS-PAGE凝胶 | Bio-Rad | -- | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| 化学发光检测系统 | Syngene | -- | |
| 生化检测 | MDA检测试剂盒 | Abcam | ab118970 |
| 铁检测试剂盒 | Abcam | ab83366 | |
| GSH检测试剂盒 | Bestbio | BB-4711 | |
| AST检测试剂盒 | Abcam | ab263882 | |
| ALT检测试剂盒 | Abcam | ab282882 | |
| 脂质ROS检测 | 脂质ROS检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | D3861 |
| 质谱与Co-IP | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| A/G琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 核蛋白提取 | NE-PER核浆蛋白提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 78835 |
| 荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| pGL3-Basic载体 | Promega | -- | |
| ChIP | ChIP检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 26159 |
| 细胞活力 | CCK8细胞计数试剂盒 | Vazyme | -- |
| 免疫荧光 | 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- |
| 荧光二抗 | Abcam | -- | |
| DAPI | Abcam | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和铁死亡诱导 | 细胞系（LX-2、HSC-T6）、erastin浓度（0-10 μM）、处理时间（24小时）、抑制剂浓度（ferrostatin-1 5 μM、Z-VAD-FMK 10 μM） 阅读提示：Methods and materials: Antibodies and reagents, Cell viability, 图2和图3图注 |
| 基因敲低和过表达 | 转染试剂（jetPRIME）、shRNA/siRNA/质粒序列和来源 阅读提示：Methods and materials: RNAi and transfection；补充表3 |
| 转录调控验证 | LCN2启动子及突变构建、ChIP引物、EMSA探针、荧光素酶报告基因系统 阅读提示：Methods and materials: Luciferase reporter assay, ChIP assay, EMSA |
| 蛋白质相互作用 | 免疫共沉淀和质谱的抗体、细胞裂解条件 阅读提示：Methods and materials: Mass spectrometry and co-IP, Nuclear extraction |
| 动物模型 | 小鼠品系和性别（8-12周龄雄性C57BL/6）、CCL4剂量（1 μl/g体重）和频率、BDL手术方案、AAV6注射剂量（1×10^12 vg/mL，100 μl）、IKE剂量（40 mg/kg）和时间 阅读提示：Methods and materials: Animal models；图7图注 |
| 铁死亡指标检测 | MDA、铁、GSH、脂质ROS检测试剂盒和操作步骤 阅读提示：Methods and materials: Biochemical assay |