单细胞转录组分析
鉴定颈动脉斑块进展中差异变化的细胞类型和单核细胞亚群
对GSE159677数据集（3个晚期斑块和3个配对早期斑块样本）进行单细胞RNA测序分析，经质量控制、聚类和注释，鉴定出6种细胞类型，并进一步对单核细胞亚群进行分析，发现4个晚期特异亚群。
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深度学习和单细胞测序分析揭示颈动脉粥样硬化斑块进展中的关键分子特征
Deep Learning and Single-Cell Sequencing Analyses Unveiling Key Molecular Features in the Progression of Carotid Atherosclerotic Plaque.
实验完整度
中研究包含单细胞测序、转录组分析、机器学习建模，以及RT-qPCR和免疫组化等初步验证，但缺乏体内外功能实验和完整机制验证。
主要模型
颈动脉粥样硬化斑块单细胞转录组样本（GSE159677） Raw264.7细胞系（LPS诱导M1巨噬细胞） 人颈动脉斑块组织（临床样本）
重点核对
单细胞数据分析中，细胞筛选标准为基因数200-2500，线粒体基因比例小于10% Raw264.7细胞以1.0×10^6/mL密度接种，用100 ng/mL LPS处理24小时 免疫组化使用抗FTH1抗体（1:200），免疫荧光使用抗FTH1（1:50）和抗CD68（1:50） 患者颈动脉斑块样本分为晚期（AC）和早期（PA）配对样本，样本量为6 RT-qPCR以β-Actin为内参，使用2^-ΔΔCt法计算表达量
摘要
晚期颈动脉粥样硬化斑块破裂增加缺血性卒中的风险，该病具有显著的全球发病率和死亡率。然而，功能失调的免疫细胞的具体特征以及用于诊断动脉粥样硬化斑块进展的经证实的生物标志物仍然缺乏特征描述。我们的研究利用单细胞RNA测序和高维加权基因共表达网络分析，阐明了免疫细胞在晚期斑块进展中的作用并探索了诊断性生物标志物。我们鉴定了一个在晚期斑块中浸润显著增加的单核细胞亚群。基于单核细胞特征和机器学习方法，我们准确区分了晚期斑块与早期斑块，在独立外部测试中曲线下面积（AUC）为0.899。使用微环境细胞群体（MCP）计数器和非负矩阵分解，我们确定了单核细胞特征与免疫细胞浸润以及患者异质性之间的关联。最后，我们构建了基于基因-免疫相关性的卷积神经网络深度学习模型，在独立外部测试中诊断晚期斑块的AUC为0.933，敏感性为92.3%，特异性为87.5%。我们关于促成颈动脉斑块进展的独特单核细胞亚群的发现对于开发临床疾病的诊断工具至关重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 颈动脉粥样硬化斑块从早期进展到晚期过程中，哪些免疫细胞亚群和分子标志物起关键作用，并可作为诊断生物标志物？
- 核心机制
- 晚期斑块中特异性单核细胞亚群（AC mono）通过SPP1和MIF信号通路与其他细胞通讯，并表现出增强的代谢重编程（如缺氧、糖酵解、胆固醇稳态和脂肪酸代谢），可能通过调控单核/巨噬细胞功能促进斑块进展。FTH1在M1巨噬细胞中高表达，可能通过调节铁代谢和抵抗铁死亡，导致促炎巨噬细胞长期存活，加剧斑块不稳定。
- 主要证据
- 基于单细胞测序鉴定出AC mono亚群，hdWGCNA和LASSO筛选出8个关键基因；随机森林模型在外部验证集AUC达0.899；CNN模型AUC达0.933；RT-qPCR和免疫组化证实FTH1在晚期斑块和M1巨噬细胞中高表达。
- 研究意义
- 该研究提供了区分早期和晚期颈动脉斑块的潜在血清标志物（如FTH1），并构建了基于基因-免疫相关性的深度学习预测模型，有助于开发靶向预防和个性化治疗方案。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞通讯分析
探索AC mono与其他细胞间的配体-受体相互作用
利用CellChat包分析单核细胞亚群与其他细胞间的配体-受体相互作用，发现AC mono主要通过SPP1和MIF信号通路作为信号发送者。
共表达网络和功能富集分析
识别与AC mono相关的关键基因模块及其生物学功能
使用hdWGCNA构建共表达网络，鉴定出与AC mono相关的模块（turquoise、green-yellow、yellow、green），提取100个枢纽基因进行GO、KEGG和Reactome富集分析，发现代谢相关通路富集。
拟时间轨迹分析
推断单核细胞的分化轨迹和AC mono在其中的位置
使用Monocle包进行拟时间分析，结果显示AC mono主要分布在轨迹早期，提示其可能具有更强的致病潜力。
机器学习诊断模型构建
基于枢纽基因构建区分晚期和早期斑块的诊断模型
对100个枢纽基因进行LASSO回归，筛选出8个关键基因，利用多种机器学习算法构建模型，并通过外部数据集验证，随机森林模型表现最佳。
分子亚型及免疫浸润分析
基于关键基因对晚期斑块进行亚型分型，并评估免疫浸润差异
使用NMF将晚期斑块分为两个亚型，通过GSVA和IOBR分析免疫浸润，发现亚型1具有更高的单核细胞和中性粒细胞浸润，并与关键基因表达相关。
深度学习模型构建
基于基因表达和免疫细胞浸润比率构建深度学习诊断模型
将关键基因表达与免疫细胞浸润数据合并生成基因-免疫热图（每位患者的画像），使用卷积神经网络（CNN）构建预测模型，并评估其诊断性能。
关键基因验证
在外部数据集和实验样本中验证关键基因的表达
在GSE43292中验证8个基因的表达趋势，通过与AC mono上调基因取交集获得FTH1，并通过RT-qPCR和免疫组化、免疫荧光验证其表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
机器学习与模型构建
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与处理 | Raw264.7细胞 | Procell | CL-0190 |
| 专用培养基 | Procell | CM-0190 | |
| 脂多糖 | SIGMA | -- | |
| RT-qPCR | RNAkey总RNA提取试剂 | Sevenbio | -- |
| Premix Pro TaqHS qPCR试剂盒 | Accurate Biotechnology | AG11718 | |
| 引物 | BGI TECH | -- | |
| 免疫组化 | 超敏SP（小鼠/兔）免疫组化试剂盒 | MXB Biotechnologies | KIT-9730 |
| 抗FTH1抗体 | Abclonal | A1144 | |
| 免疫荧光 | 抗FTH1抗体 | Abclonal | -- |
| 抗CD68抗体 | Abcam | ab955 | |
| 山羊抗兔IgG H&L | Abcam | ab150080 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L | Abcam | ab150113 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Solarbio | C0065 | |
| 荧光显微镜 | Thermo Fisher | Evos | |
| 免疫组化定量 | Image-Pro Plus 6.0软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞测序数据处理 | 细胞筛选标准（基因数200-2500，线粒体基因比例<10%），批次效应消除方法（Harmony） 阅读提示：Methods 2.1 |
| 细胞培养与处理 | 细胞系（Raw264.7）、接种密度（1.0×10^6/mL）、LPS浓度（100 ng/mL）及处理时间（24小时） 阅读提示：Methods 2.12 |
| RT-qPCR | 内参基因（β-Actin），定量方法（2^-ΔΔCt），引物序列（见Data S1） 阅读提示：Methods 2.13 |
| 免疫组化 | 样本固定和切片（4%中性甲醛固定，石蜡包埋，5mm厚切片），抗原修复，抗体稀释度（抗FTH1 1:200） 阅读提示：Methods 2.14 |
| 免疫荧光 | 封闭条件（Beyotime P0260，30分钟），一抗浓度（FTH1 1:50，CD68 1:50），二抗浓度（1:500），DAPI染色 阅读提示：Methods 2.14 |
| 机器学习模型 | 训练集（GSE163154）和测试集（GSE28829），随机森林模型参数，CNN模型结构（卷积层数、过滤器数量、池化层等） 阅读提示：Methods 2.7和2.10 |