lysoTRAP的构建与表征
验证从活化巨噬细胞分离的溶酶体具有增强的降解活性，并成功在溶酶体表面锚定ACE2受体。
LPS刺激小鼠原代巨噬细胞，通过物理破碎和差速离心提取溶酶体；将DSPE-PEG-NTA-Ni插入溶酶体膜，并通过NTA-Ni/His亲和力锚定ACE2-His标签融合蛋白，构建lysoTRAP。通过TEM、CLSM、ELISA和酶活性检测表征其形态、锚定效率和酶活性。
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溶酶体“TRAP”：一种清除病毒及其变异株的新型模式
Lysosomal "TRAP": a neotype modality for clearance of viruses and variants.
实验完整度
高包含体外细胞实验、小鼠和仓鼠体内感染模型、人肺类器官模型等多层次证据，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
ACE2-OE HEK293T细胞 C57BL/6小鼠 hACE2 C57BL/6小鼠 仓鼠 人肺类器官
重点核对
lysoTRAP的构建：从LPS激活的巨噬细胞中分离溶酶体，通过DSPE-PEG-NTA-Ni和His标签锚定ACE2。 体外清除假型病毒：10 μg lysoTRAP与5×10^8 TU假型病毒在37°C孵育，24小时内蛋白和RNA几乎完全降解。 体内清除假型病毒：hACE2小鼠经胸腔注射1×10^6 TU假型病毒，1小时后经肺吸入lysoTRAP，2天后GFP信号显著降低。 体内清除真实病毒：仓鼠经鼻内攻毒2×10^4 TCID50 SARS-CoV-2，1小时、1天、2天后经肺吸入5 mg/kg lysoTRAP，3天后病毒RNA降低>3 log。 人肺类器官实验：100 TCID50真实SARS-CoV-2与100 μg/mL h-lysoTRAP共孵育，2天后病毒RNA显著降低。
摘要
病毒与宿主进入因子受体的结合是病毒感染的关键步骤。许多研究表明，巨噬细胞可以在体内内化病毒并在溶酶体中降解以清除病毒。受这些自然行为的启发，并以SARS-CoV-2为试验平台，我们从活化的巨噬细胞中提取溶酶体，并锚定蛋白受体ACE2作为诱饵，从而构建了一种溶酶体“TRAP”（lysoTRAP），可选择性地捕获、内化并最终降解SARS-CoV-2。通过细胞、雌性小鼠、雌性仓鼠和人肺类器官实验，我们证明了lysoTRAP能有效清除SARS-CoV-2。重要的是，与靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的治疗药物不同，lysoTRAP对九种假型变异株和真实Omicron变异株仍然有效，证明了其对SARS-CoV-2突变的抵抗性。除了蛋白受体ACE2，我们还将lysoTRAP扩展至糖受体唾液酸，并验证了其对H1N1的优异抗病毒效果，凸显了我们的“TRAP”平台在对抗多种病毒方面的灵活性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否构建一种模拟巨噬细胞清除病毒功能的溶酶体“TRAP”平台，通过捕获、内化和降解来清除SARS-CoV-2及其变异株，并扩展至其他病毒？
- 核心机制
- lysoTRAP通过表面锚定的ACE2受体特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白，经膜融合内化病毒，利用溶酶体内的蛋白酶和核酸酶在酸性环境中降解病毒蛋白和基因组，从而阻断病毒感染。
- 主要证据
- 体外实验显示lysoTRAP能捕获、内化并降解假型SARS-CoV-2（野生型和9种变异株），抑制ACE2-OE HEK293T细胞感染；小鼠和仓鼠模型中，肺吸入lysoTRAP显著降低病毒载量和病理损伤；人肺类器官中，h-lysoTRAP比RBD抗体和EIDD-2801更有效，且对Omicron变异株同样有效。
- 研究意义
- 作者提出lysoTRAP作为一种新型的广谱抗病毒策略，通过改变诱饵受体可适应不同病毒，具有抗突变、可冻干储存、低免疫原性等优势，为未来病毒防治提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外清除假型SARS-CoV-2的性能评估
验证lysoTRAP对假型SARS-CoV-2的捕获、内化和降解能力。
使用QCM检测捕获能力，CLSM、STED和TEM观察内化过程，ELISA、WB、q-PCR和RNA电泳检测降解效果。
体外抑制假型病毒感染实验
验证lysoTRAP能有效抑制假型SARS-CoV-2对宿主细胞的感染，并评估其对多种变异株的效力。
在ACE2-OE HEK293T细胞中，将假型病毒与lysoTRAP、游离ACE2或裸溶酶体共孵育，通过GFP表达和流式细胞术检测感染率，并测试9种变异株。
体内分布与安全性评估
评估lysoTRAP经肺吸入后的生物分布、安全性和生物相容性。
Cy7标记的lysoTRAP经静脉注射或肺吸入给予C57BL/6小鼠，通过活体荧光成像和组织成像分析分布；通过H&E染色、细胞因子水平和肺功能评估安全性。
体内清除假型SARS-CoV-2实验
验证lysoTRAP在体内能有效清除假型SARS-CoV-2并抑制感染。
C57BL/6或hACE2小鼠经胸腔注射假型病毒，1小时后经肺吸入lysoTRAP，通过组织切片、WB、q-PCR和活体成像评估病毒清除效果。
体内清除真实SARS-CoV-2实验（仓鼠模型）
验证lysoTRAP对真实SARS-CoV-2（野生型和Omicron变异株）的清除效果。
仓鼠经鼻内攻毒2×10^4 TCID50真实SARS-CoV-2，1小时、1天、2天后经肺吸入lysoTRAP（5 mg/kg），3天后检测病毒RNA、S蛋白表达和组织病理。
人lysoTRAP构建及体外清除真实病毒
验证人lysoTRAP（h-lysoTRAP）能有效捕获、内化和降解真实SARS-CoV-2。
从人外周血分离CD14+细胞，经GM-CSF分化和LPS激活为巨噬细胞，提取溶酶体并锚定ACE2，构建h-lysoTRAP。通过QCM、TEM、蛋白质组学、毛细管电泳和q-PCR验证其功能。
人肺类器官模型验证h-lysoTRAP清除真实病毒
在更接近人体的模型中验证h-lysoTRAP对真实SARS-CoV-2的清除能力。
构建人肺类器官，感染100 TCID50真实SARS-CoV-2（野生型或Omicron变异株）并同时加入h-lysoTRAP或对照药物（EIDD-2801、RBD抗体），检测病毒RNA、S蛋白表达、LDH释放和类器官形态。
扩展至H1N1流感病毒
验证将溶酶体表面修饰唾液酸（SA）后，lysoTRAP(SA)能清除H1N1流感病毒。
通过SIAT1和CMP-SA将SA修饰到溶酶体表面，构建lysoTRAP(SA)。通过QCM、TEM、FRET、ELISA和q-PCR验证其捕获和降解H1N1病毒的能力，并在小鼠和人肺类器官模型中评估体内清除效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | BI | -- |
| 胎牛血清 | GIBCO | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 细胞因子 | 重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- |
| 细胞活化 | 脂多糖 | -- | -- |
| 溶酶体提取 | 溶酶体提取试剂盒 | Bestbio | -- |
| 溶酶体纯化 | LAMP-1免疫磁珠 | Dynabeads | -- |
| 抗体 | 抗人ACE2抗体 | Abcam | ab272500 |
| 抗LAMP-2抗体 | Abcam | ab25631 | |
| 抗LAMP-1抗体 | Abcam | ab24170 | |
| 抗S1抗体 | Abcam | ab281311 | |
| 抗H1N1 N蛋白抗体 | Abcam | ab104870 | |
| 抗HIV1 p55-p24-p17抗体 | Abcam | ab309159 | |
| 抗SARS-CoV-2刺突糖蛋白S2抗体 | Abcam | ab283913 | |
| 抗HA抗体 | Abcam | ab281948 | |
| 重组蛋白 | 人ACE2蛋白 | Sino Biological | 10108-H08H |
| 药物处理 | EIDD-2801 | MedChemExpress | -- |
| 荧光染料 | 花青素5 NHS酯 | FANBO biochemicals | -- |
| 花青素7 NHS酯 | FANBO biochemicals | -- | |
| 类器官培养 | 人肺类器官培养试剂盒 | K2ONCOLOGY | -- |
| 基质胶 | Corning/BD | -- | |
| 蛋白质浓度测定 | Micro BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | PI23235 |
| 酶活性检测 | ACE2活性荧光检测试剂盒 | Beyotime | P0139S |
| 组织蛋白酶L检测试剂盒 | Abcam | ab270774 | |
| 组织蛋白酶B检测试剂盒 | Abcam | ab270772 | |
| 酸性蛋白酶活性检测试剂盒 | Solarbio | BC2280 | |
| 核糖核酸酶活性荧光检测试剂盒 | Beyotime | P0347S | |
| 溶酶体酸度检测 | 溶酶体酸性指示剂 | TongRen Chemical | L264 |
| 酶活性检测 | 弗林蛋白酶检测试剂盒 | Bioscience | 78040 |
| qRT-PCR | BeyoFast SYBR Green一步法qRT-PCR试剂盒 | Beyotime | D7268s |
| One Step PrimeScript q-PCR试剂盒 | TCI | RR064A | |
| RNA提取 | RNAeasy病毒RNA提取试剂盒（离心柱） | Beyotime | R0035L |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 细胞凋亡检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| electroporation | 亮抑酶肽 | -- | -- |
| 胃蛋白酶抑制剂A | -- | -- | |
| E-64 | -- | -- | |
| 核糖核酸酶抑制剂 | -- | -- | |
| 荧光标记 | BODIPY荧光染料 | -- | -- |
| Cy5 NHS酯 | -- | -- | |
| Cy7 NHS酯 | -- | -- | |
| Cy5.5荧光染料 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 异硫氰酸荧光素 | Solarbio Life Sciences | -- | |
| 链霉亲和素-FITC | Solarbio Life Sciences | -- | |
| 尼罗红标记的鬼笔环肽 | -- | -- | |
| 抑制剂 | 巴弗洛霉素A1 | -- | -- |
| 细胞松弛素B | Solarbio Life Sciences | -- | |
| 细胞分离 | CD14磁珠 | -- | -- |
| Ficoll-Paque密度梯度分离液 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素 | Biological Industries | -- |
| 胰蛋白酶-EDTA | Biological Industries | -- | |
| 基质胶 | Corning Inc. | -- | |
| 类器官构建 | Advanced DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胶原酶 | -- | -- | |
| 动物实验 | 阿佛丁（三溴乙醇） | -- | -- |
| 仪器 | 透射电子显微镜 | JEOL | JSM-6700 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Nikon | -- | |
| 受激发射损耗显微镜 | Leica | SP8 | |
| 纳米颗粒跟踪分析仪 | Malvern Instruments | Mastersizer | |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
| 多功能酶标仪 | PerkinElmer | EnVision | |
| 小动物活体成像系统 | Kodak | FX | |
| 光片显微镜 | Zeiss | Z.1 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1950 | |
| 全身体积描记系统 | BUXCO | -- | |
| Vectra病理成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | CFX96 | |
| Q Exactive混合四极杆-Orbitrap质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EASY nLC 1200超高压液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FAIMS Pro接口 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| QIAxcel Advanced毛细管电泳系统 | QIAGEN | -- | |
| 酶标仪 | Tecan | Infinite | |
| 液体气溶胶装置（微型喷雾器） | Huironghe Company | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| lysoTRAP构建 | 巨噬细胞来源（小鼠、仓鼠、人）、LPS浓度（1 ng/mL）和刺激时间（48小时）、溶酶体提取试剂盒、DSPE-PEG-NTA-Ni的浓度和孵育时间（37°C 1小时）、ACE2蛋白的浓度和孵育时间（37°C 1小时） 阅读提示：Methods: Preparation of lysoTRAP |
| 体外清除假型病毒实验 | lysoTRAP与假型病毒的比值（10 μg lysoTRAP与5×10^8 TU病毒，即1:5）、孵育温度（37°C）、检测时间点（0, 1, 4, 12, 24小时） 阅读提示：Methods: Programmed performance of lysoTRAP... in vitro |
| 细胞感染抑制实验 | ACE2-OE HEK293T细胞密度（10,000细胞/孔）、假型病毒量（5×10^4 TU/孔）、lysoTRAP浓度（100 μg/mL）、共孵育时间（2天） 阅读提示：Methods: Pseudotyped virion infection assay |
| 小鼠体内分布实验 | 小鼠品系（C57BL/6）和性别（雌性）、lysoTRAP剂量（100 μg/只）、给药方式（肺吸入或静脉注射）、成像时间点（0-24小时） 阅读提示：Methods: In vivo biodistribution of lysoTRAP |
| 小鼠体内清除假型病毒实验 | 小鼠品系（C57BL/6和hACE2）和性别（雌性）、假型病毒量（1×10^6 TU）和注射方式（胸腔注射）、lysoTRAP给药时间（1小时后）和给药方式（肺吸入）、组织收集时间（1天或2天） 阅读提示：Methods: Programmed performance of lysoTRAP... in vivo |
| 仓鼠体内清除真实病毒实验 | 仓鼠品系（雌性）、攻毒剂量（2×10^4 TCID50）和途径（鼻内）、lysoTRAP剂量（5 mg/kg）和给药时间（1小时、1天、2天后） 阅读提示：Methods: In vivo clearance of authentic SARS-CoV-2 by lysoTRAP in hamster model |
| 人肺类器官清除病毒实验 | 类器官培养条件（Matrigel）、病毒感染量（100 TCID50/孔）、h-lysoTRAP浓度（100 μg/mL）、对照药物浓度（匹配ACE2量）、孵育时间（2天） 阅读提示：Methods: h-lysoTRAP clearing authentic SARS-CoV-2 on human lung organoids |
| H1N1清除实验 | 溶酶体表面SA修饰条件（SIAT1和CMP-SA浓度、孵育时间）、H1N1攻毒剂量（小鼠1000 TCID50）、lysoTRAP(SA)给药时间和途径 阅读提示：Methods: lysoTRAP inhibiting influenza virus infection |
| 稳定性实验 | 储存条件（4°C、六个月）、冻干保护剂（50 mM trehalose和100 mM mannitol）、复溶后检测指标 阅读提示：Methods: Characterizations of lysoTRAP |
| 安全性评估 | 内毒素水平、H&E染色、细胞因子水平（IL-6, TNF, IFN-γ）、肺功能（呼吸频率、潮气量） 阅读提示：Methods: Safety evaluation of lysoTRAP |