振荡电场刺激通过miR-124/Tal1轴促进神经干细胞神经发生以修复大鼠脊髓损伤

Oscillating field stimulation promotes neurogenesis of neural stem cells through miR-124/Tal1 axis to repair spinal cord injury in rats.

作者信息Chao Fang, Jian Sun, Jun Qian, Cai-Liang Shen
PMID36204860
发布时间2023-04
DOI10.4103/1673-5374.353505

实验完整度

包含体外细胞培养与慢病毒敲低、体内大鼠SCI模型与OFS植入、行为学、组织学及分子检测等独立证据层级。

主要模型

C57BL/6小鼠来源的神经干细胞(GFP标记) 成年雌性Sprague-Dawley大鼠脊髓挫伤模型

重点核对

神经干细胞来源于12.5天胚胎C57BL/6小鼠前脑,携带GFP报告基因 SCI诱导使用NYU impactor,10g重量从3cm高度打击T9-T10 NSC移植量为2×10^5细胞/3μL培养基 OFS参数:强度400 μV/mm,输出电流40 μA,极性每15分钟切换 BBB评分在术后3、7、14、21、28天进行

摘要

脊髓损伤常导致严重的感觉和运动功能障碍,目前可用疗法的预后仍然不佳。因此,我们旨在探索一种改善脊髓损伤预后的新型治疗方法。在本研究中,我们将振荡电场刺激装置植入大鼠胸段(T9–T10)脊髓挫伤部位,并移植神经干细胞。Basso-Beattie-Bresnahan评分显示,振荡电场刺激联合神经干细胞移植促进了脊髓损伤后运动功能的恢复。此外,我们研究了振荡电场刺激对神经干细胞中miR-124/Tal1轴的调控。通过慢病毒转染研究Tal1在振荡电场刺激诱导的神经干细胞神经发生中的作用。定量逆转录聚合酶链反应、免疫荧光和蛋白质印迹显示,振荡电场刺激在体外和体内促进了神经干细胞的神经发生。苏木精和伊红染色显示,振荡电场刺激联合神经干细胞移植减轻了脊髓损伤后空洞的形成。综合这些结果,我们得出结论:振荡电场刺激降低了miR-124的表达,增加了Tal1的含量,从而促进了神经干细胞的神经发生。振荡电场刺激与神经干细胞移植的结合改善了神经发生,从而促进了脊髓损伤后的结构和功能恢复。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
振荡电场刺激能否通过调控miR-124/Tal1轴促进移植的神经干细胞神经发生,从而修复大鼠脊髓损伤?
核心机制
振荡电场刺激降低miR-124表达,增加Tal1含量,从而促进神经干细胞神经发生。
主要证据
体外qRT-PCR和蛋白质印迹显示OFS组β-tubulin III表达和Tal1表达升高,而miR-124降低;LV-Tal1敲低后β-tubulin III降低;体内免疫荧光和蛋白质印迹显示NSC+OFS组GFP和β-tubulin III阳性细胞数及NF-H蛋白表达高于NSC组;H&E染色显示NSC+OFS组空洞面积更小;BBB评分在术后21和28天NSC+OFS组高于NSC组。
研究意义
该研究为脊髓损伤提供了一种安全有效的治疗策略,即振荡电场刺激联合神经干细胞移植。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

神经干细胞培养与转染

培养GFP标记的神经干细胞并敲低Tal1以研究其在神经发生中的作用

从12.5天胚胎C57BL/6小鼠前脑分离NSCs,培养于生长培养基;使用TAL1 shRNA-ZsGreen慢病毒(LV-Tal1)和对照慢病毒(LV-NC)转染NSCs。

2

体外神经干细胞分化与OFS刺激

验证OFS对NSCs神经发生的影响及其机制

将NSCs以1×10^5/孔接种于分化培养基,OFS组置于不锈钢培养皿中接受连续OFS刺激7天,对照组常规培养;分化培养基每2天更换。

3

体外检测神经发生标志物和miR-124/Tal1表达

定量分析β-tubulin III、miR-124和Tal1的表达水平

收取分化7天的NSCs,进行qRT-PCR检测miR-124、Tal1和β-tubulin III mRNA;蛋白质印迹检测β-tubulin III蛋白;免疫荧光检测β-tubulin III。

4

大鼠脊髓损伤模型建立与治疗分组

建立脊髓挫伤模型并进行OFS联合NSCs移植治疗

成年雌性SD大鼠随机分为SCI、NSC、NSC+OFS三组,使用NYU impactor建立T9-T10脊髓挫伤模型;SCI组注射培养基,NSC组和NSC+OFS组移植NSCs;NSC+OFS组植入OFS装置。

5

行为学评估

评估运动功能恢复

在术后3、7、14、21、28天进行BBB评分,由两名评估员打分。

6

组织学分析

评估脊髓组织结构和空洞形成

术后14天取脊髓组织固定包埋切片,进行H&E染色,测量空洞相对面积。

7

体内神经发生和轴突再生检测

验证OFS对移植NSCs神经发生和轴突再生的影响

在术后3、7、14天进行免疫荧光双标(GFP和β-tubulin III)检测神经发生;在术后14天进行NF-H免疫荧光和蛋白质印迹检测轴突再生。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
T25培养瓶----
C57BL/6小鼠神经干细胞生长培养基Cyagen Biosciences Inc.MUBNF-90011
湿润培养箱Thermo Fisher Scientific--
TAL1 shRNA-ZsGreen慢病毒HanbioLV61110952
ZsGreen-NC慢病毒Hanbio--
DMEM/F12培养基ProcellPM150312
N2添加剂Gibco17502048
胎牛血清Procell164210
不锈钢细胞培养皿----
NYU撞击器New York University--
微量注射器Hamilton--
OFS装置Chinese Academy of Sciences--
电池(CR1220)--CR1220
感应系统(74HC4060)Texas Instruments74HC4060
青霉素G----
切片机(RM2255)LeicaRM2255
显微镜(Eclipse E100)NikonEclipse
Image-Pro Plus 6.0Media Cybernetics--
RNAprep Pure Micro试剂盒TianGenDP420
RT Plus试剂盒SparkJadeAG0304
qPCR混合液SparkJadeAH0104
ABI QuantStudio 6 FlexThermo Fisher Scientific--
Triton X-100SolarbioT8200
β-tubulin III抗体GeneTexGTX130245
NF-H抗体Abcamab8135
Cy3偶联山羊抗兔IgGServicebioGB21303
FITC偶联驴抗山羊IgGServicebioGB22404
GFP抗体Abcamab290
Alexa Fluor 488偶联山羊抗兔IgGABclonalAS053
DAPIServicebioG1012
多聚-D-赖氨酸包被的24孔板----
荧光显微镜(Eclipse C1)NikonEclipse
RIPA裂解缓冲液SolarbioR0010
聚偏二氟乙烯膜Merck MilliporeIPVH00010
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgGElabscienceE-AB-1003
GAPDH抗体ABclonalA19056
β-actin抗体ABclonalAC026
SPSS 19.0IBM--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
神经干细胞培养与转染
细胞来源:12.5天胚胎C57BL/6小鼠前脑,携带GFP;培养基成分;慢病毒LV-Tal1和LV-NC的滴度或用量
阅读提示:Methods: NSCs culture and transfection
体外分化与OFS处理
细胞密度:1×10^5/孔;分化培养基成分;OFS参数:强度400 μV/mm,电流40 μA;刺激持续时间:7天
阅读提示:Methods: NSCs differentiation; Figure 1
SCI建模
大鼠品系:雌性SD大鼠,8周龄,220-240g;麻醉剂量:1%戊巴比妥钠40 mg/kg;SCI诱导参数:NYU impactor,10g,3cm高度
阅读提示:Methods: Animals; SCI induction and OFS treatment
细胞移植
移植细胞量:2×10^5 NSCs在3μL培养基中;注射位置:病灶中心;注射后停留5分钟
阅读提示:Methods: SCI induction and OFS treatment
OFS装置植入
电极缝合位置:病灶上下段椎旁肌肉;刺激强度400 μV/mm,输出电流40 μA;电池型号CR1220
阅读提示:Methods: SCI induction and OFS treatment; Jing et al., 2015
行为学评估
评分时间点:术后3、7、14、21、28天;每组5只;评估员人数
阅读提示:Methods: Behavioral analysis; Figure 3
组织学分析
取材时间:术后14天;切片厚度10μm;测量指标:空洞面积
阅读提示:Methods: Hematoxylin and eosin staining; Figure 4