神经干细胞培养与转染
培养GFP标记的神经干细胞并敲低Tal1以研究其在神经发生中的作用
从12.5天胚胎C57BL/6小鼠前脑分离NSCs,培养于生长培养基;使用TAL1 shRNA-ZsGreen慢病毒(LV-Tal1)和对照慢病毒(LV-NC)转染NSCs。
Oscillating field stimulation promotes neurogenesis of neural stem cells through miR-124/Tal1 axis to repair spinal cord injury in rats.
包含体外细胞培养与慢病毒敲低、体内大鼠SCI模型与OFS植入、行为学、组织学及分子检测等独立证据层级。
C57BL/6小鼠来源的神经干细胞(GFP标记) 成年雌性Sprague-Dawley大鼠脊髓挫伤模型
神经干细胞来源于12.5天胚胎C57BL/6小鼠前脑,携带GFP报告基因 SCI诱导使用NYU impactor,10g重量从3cm高度打击T9-T10 NSC移植量为2×10^5细胞/3μL培养基 OFS参数:强度400 μV/mm,输出电流40 μA,极性每15分钟切换 BBB评分在术后3、7、14、21、28天进行
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
培养GFP标记的神经干细胞并敲低Tal1以研究其在神经发生中的作用
从12.5天胚胎C57BL/6小鼠前脑分离NSCs,培养于生长培养基;使用TAL1 shRNA-ZsGreen慢病毒(LV-Tal1)和对照慢病毒(LV-NC)转染NSCs。
验证OFS对NSCs神经发生的影响及其机制
将NSCs以1×10^5/孔接种于分化培养基,OFS组置于不锈钢培养皿中接受连续OFS刺激7天,对照组常规培养;分化培养基每2天更换。
定量分析β-tubulin III、miR-124和Tal1的表达水平
收取分化7天的NSCs,进行qRT-PCR检测miR-124、Tal1和β-tubulin III mRNA;蛋白质印迹检测β-tubulin III蛋白;免疫荧光检测β-tubulin III。
建立脊髓挫伤模型并进行OFS联合NSCs移植治疗
成年雌性SD大鼠随机分为SCI、NSC、NSC+OFS三组,使用NYU impactor建立T9-T10脊髓挫伤模型;SCI组注射培养基,NSC组和NSC+OFS组移植NSCs;NSC+OFS组植入OFS装置。
评估运动功能恢复
在术后3、7、14、21、28天进行BBB评分,由两名评估员打分。
评估脊髓组织结构和空洞形成
术后14天取脊髓组织固定包埋切片,进行H&E染色,测量空洞相对面积。
验证OFS对移植NSCs神经发生和轴突再生的影响
在术后3、7、14天进行免疫荧光双标(GFP和β-tubulin III)检测神经发生;在术后14天进行NF-H免疫荧光和蛋白质印迹检测轴突再生。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 神经干细胞培养 | T25培养瓶 | -- | -- |
| C57BL/6小鼠神经干细胞生长培养基 | Cyagen Biosciences Inc. | MUBNF-90011 | |
| 湿润培养箱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 基因敲低 | TAL1 shRNA-ZsGreen慢病毒 | Hanbio | LV61110952 |
| ZsGreen-NC慢病毒 | Hanbio | -- | |
| 细胞分化 | DMEM/F12培养基 | Procell | PM150312 |
| N2添加剂 | Gibco | 17502048 | |
| 胎牛血清 | Procell | 164210 | |
| 不锈钢细胞培养皿 | -- | -- | |
| SCI诱导 | NYU撞击器 | New York University | -- |
| 微量注射器 | Hamilton | -- | |
| OFS治疗 | OFS装置 | Chinese Academy of Sciences | -- |
| 电池(CR1220) | -- | CR1220 | |
| 感应系统(74HC4060) | Texas Instruments | 74HC4060 | |
| 预防感染 | 青霉素G | -- | -- |
| 组织学分析 | 切片机(RM2255) | Leica | RM2255 |
| 显微镜(Eclipse E100) | Nikon | Eclipse | |
| Image-Pro Plus 6.0 | Media Cybernetics | -- | |
| qRT-PCR | RNAprep Pure Micro试剂盒 | TianGen | DP420 |
| RT Plus试剂盒 | SparkJade | AG0304 | |
| qPCR混合液 | SparkJade | AH0104 | |
| ABI QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光染色 | Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
| β-tubulin III抗体 | GeneTex | GTX130245 | |
| NF-H抗体 | Abcam | ab8135 | |
| Cy3偶联山羊抗兔IgG | Servicebio | GB21303 | |
| FITC偶联驴抗山羊IgG | Servicebio | GB22404 | |
| GFP抗体 | Abcam | ab290 | |
| Alexa Fluor 488偶联山羊抗兔IgG | ABclonal | AS053 | |
| DAPI | Servicebio | G1012 | |
| 多聚-D-赖氨酸包被的24孔板 | -- | -- | |
| 荧光显微镜(Eclipse C1) | Nikon | Eclipse | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解缓冲液 | Solarbio | R0010 |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Elabscience | E-AB-1003 | |
| GAPDH抗体 | ABclonal | A19056 | |
| β-actin抗体 | ABclonal | AC026 | |
| 统计分析 | SPSS 19.0 | IBM | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 神经干细胞培养与转染 | 细胞来源:12.5天胚胎C57BL/6小鼠前脑,携带GFP;培养基成分;慢病毒LV-Tal1和LV-NC的滴度或用量 阅读提示:Methods: NSCs culture and transfection |
| 体外分化与OFS处理 | 细胞密度:1×10^5/孔;分化培养基成分;OFS参数:强度400 μV/mm,电流40 μA;刺激持续时间:7天 阅读提示:Methods: NSCs differentiation; Figure 1 |
| SCI建模 | 大鼠品系:雌性SD大鼠,8周龄,220-240g;麻醉剂量:1%戊巴比妥钠40 mg/kg;SCI诱导参数:NYU impactor,10g,3cm高度 阅读提示:Methods: Animals; SCI induction and OFS treatment |
| 细胞移植 | 移植细胞量:2×10^5 NSCs在3μL培养基中;注射位置:病灶中心;注射后停留5分钟 阅读提示:Methods: SCI induction and OFS treatment |
| OFS装置植入 | 电极缝合位置:病灶上下段椎旁肌肉;刺激强度400 μV/mm,输出电流40 μA;电池型号CR1220 阅读提示:Methods: SCI induction and OFS treatment; Jing et al., 2015 |
| 行为学评估 | 评分时间点:术后3、7、14、21、28天;每组5只;评估员人数 阅读提示:Methods: Behavioral analysis; Figure 3 |
| 组织学分析 | 取材时间:术后14天;切片厚度10μm;测量指标:空洞面积 阅读提示:Methods: Hematoxylin and eosin staining; Figure 4 |