建立LPS/D-GalN诱导的ALF小鼠模型
模拟急性肝衰竭的病理状态，评估肝损伤和炎症反应。
BALB/c小鼠腹腔注射LPS（10 μg/kg）和D-GalN（600 mg/kg），分别于3、12、24小时后处死，收集血清和肝组织。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
HMGB1-A box通过HMGB1/TLR-4/NF-κB信号在急性肝衰竭小鼠模型中抑制炎症性肝损伤
Inhibition of inflammatory liver injury by the HMGB1-A box through HMGB1/TLR-4/NF-κB signaling in an acute liver failure mouse model.
实验完整度
高包含小鼠体内模型和细胞体外模型两个独立证据层级，并通过H&E、Masson染色、免疫组化、Western blot、ELISA、MTT和共聚焦显微镜进行功能与机制验证。
主要模型
LPS/D-GalN诱导的BALB/c小鼠急性肝衰竭模型 LPS处理的Huh7人肝癌细胞系
重点核对
LPS/D-GalN诱导小鼠模型：LPS剂量10 μg/kg，D-GalN剂量600 mg/kg，腹腔注射，观察时间点3、12、24小时 HMGB1-A box处理：小鼠剂量400 μg，腹腔注射，于造模前1小时给药 Huh7细胞LPS处理浓度：1000 ng/ml，处理时间3、9、16、24、48小时 Huh7细胞HMGB1-A box处理浓度：50或100 ng/ml，与LPS共处理24小时 样本量：动物和细胞实验均重复3次（n=3）
摘要
我们旨在研究高迁移率族蛋白B1（HMGB1）-A box的预防作用及其通过抑制HMGB1的细胞外释放减轻急性肝衰竭（ALF）炎症损伤的机制。BALB/c小鼠腹腔注射LPS/D-GalN建立ALF小鼠模型。在建立ALF小鼠模型前1小时腹腔注射HMGB1-A box。通过免疫组织化学、蛋白质印迹和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测肝组织和/或血清中细胞外释放的HMGB1、TLR-4/NF-κB信号分子、促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2的水平。在Huh7细胞中，通过共聚焦显微镜、蛋白质印迹和ELISA检测LPS和/或HMGB1-A box处理后细胞外释放的HMGB1、TLR-4/NF-κB信号分子和促炎细胞因子的水平。在ALF小鼠模型中，肝和血清中HMGB1的水平显著升高，TLR-4/NF-κB信号分子和促炎细胞因子也上调。值得注意的是，HMGB1-A box可以逆转这些变化。HMGB1-A box在LPS诱导的Huh7细胞中也能引起这些变化。HMGB1-A box通过调节LPS/D-GalN诱导的ALF小鼠模型中的HMGB1/TLR-4/NF-κB信号传导，抑制炎症性肝损伤，发挥保护作用，这可能与抑制HMGB1的细胞外释放有关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HMGB1-A box是否通过抑制HMGB1的细胞外释放来减轻LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭中的炎症性肝损伤？
- 核心机制
- HMGB1-A box通过抑制HMGB1从细胞核向细胞外的释放，下调TLR-4/NF-κB信号通路，减少促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和COX-2的表达，从而减轻炎症性肝损伤。
- 主要证据
- 在LPS/D-GalN诱导的ALF小鼠模型中，HMGB1-A box预处理降低了肝组织和血清中HMGB1水平、TLR-4、NF-κB和MyD88的表达以及血清促炎因子水平；在LPS处理的Huh7细胞中，HMGB1-A box共处理减少了细胞外HMGB1释放、TLR-4/NF-κB信号分子表达和促炎因子水平，并恢复了细胞活力。
- 研究意义
- HMGB1-A box可能作为HMGB1的特异性拮抗剂，为急性肝衰竭的治疗提供新的策略和理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HMGB1-A box预处理
验证HMGB1-A box对ALF小鼠模型的保护作用。
在造模前1小时腹腔注射HMGB1-A box（400 μg），24小时后处死小鼠，评估肝损伤和炎症指标。
肝组织病理学检查
评估肝组织坏死、炎症细胞浸润和纤维化程度。
肝组织固定、包埋、切片后，进行H&E和Masson染色，显微镜下观察。
检测HMGB1表达和释放
检测HMGB1在肝组织和血清中的表达及细胞外释放。
使用免疫组化检测肝组织中HMGB1定位，Western blot检测肝组织和血清中HMGB1水平。
检测TLR-4/NF-κB信号通路和促炎因子
评估炎症信号通路和促炎因子的变化。
Western blot检测肝组织中TLR-4、NF-κB和MyD88的表达，ELISA检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2水平。
LPS处理的Huh7细胞模型
在体外验证LPS诱导的炎症和HMGB1释放。
Huh7细胞用LPS（1000 ng/ml）处理不同时间，检测细胞活力、促炎因子、HMGB1表达和释放。
HMGB1-A box在Huh7细胞中的保护作用
验证HMGB1-A box对LPS诱导的细胞凋亡和炎症的抑制作用。
Huh7细胞与LPS（1000 ng/ml）和HMGB1-A box（50或100 ng/ml）共处理24小时，检测细胞活力、促炎因子、HMGB1释放和TLR-4/NF-κB信号。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型建立 | 脂多糖（大肠杆菌0111:B4） | Sigma-Aldrich | L4391 |
| D-半乳糖胺 | Sigma-Aldrich | G0500 | |
| 药物处理 | HMGB1-A box | HMGBiotech | HM-014 |
| 病理学检查 | 显微镜（Axio Imager M2） | Carl Zeiss | -- |
| 免疫组织化学 | 抗HMGB1抗体 | Abcam | ab18256 |
| 抗兔IgG | Abcam | ab6721 | |
| 血清生化检测 | 多参数分析仪（AU 5400） | Olympus | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 蛋白提取 | 核质提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78835 |
| 细胞活力检测 | 噻唑蓝四唑溴化物 | Sigma | M2128 |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D4540 | |
| 共聚焦显微镜 | 罗丹明标记的抗兔IgG | Jackson ImmunoRes Lab | 143572 |
| DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | |
| Zeiss LSM 700激光扫描共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| ELISA | TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2 ELISA试剂盒 | Shanghai Jianglai Biological Technology | -- |
| Western blotting | Pierce™ BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 抗白蛋白抗体 | Abcam | ab207327 | |
| 抗NF-κB抗体 | Abcam | ab16502 | |
| 抗TLR-4抗体 | Abcam | ab13556 | |
| 抗MyD88抗体 | Abcam | ab219413 | |
| 抗lamin B抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-6216 | |
| ECL检测试剂 | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | LPS和D-GalN的剂量、给药途径（腹腔注射）、小鼠品系（BALB/c）、周龄和体重、观察时间点（3、12、24小时） 阅读提示：参见Materials and methods 'LPS/D-GalN-induced ALF mouse model and high mobility group box 1-A box administration' |
| HMGB1-A box预处理 | HMGB1-A box的剂量（400 μg）、给药途径（腹腔注射）和给药时间（造模前1小时） 阅读提示：参见Materials and methods 'LPS/D-GalN-induced ALF mouse model and high mobility group box 1-A box administration' |
| 细胞培养和处理 | Huh7细胞来源、培养条件（DMEM+10%FBS+1%青霉素-链霉素，5%CO2，37℃）、LPS浓度（1000 ng/ml）、处理时间（3-48小时）、HMGB1-A box浓度（50或100 ng/ml）和共处理时间（24小时） 阅读提示：参见Materials and methods 'Cell culture'和'Treatment with LPS and high mobility group box 1-A box' |
| 分子检测 | Western blot中使用的抗体及其稀释度、ELISA试剂盒品牌、免疫组化抗体稀释度 阅读提示：参见Materials and methods 'Immunohistochemistry'、'Western blotting'和'Enzyme-linked immunosorbent assay' |