建立DPN动物模型和细胞模型
模拟糖尿病周围神经病变的病理状态，用于评估CQYG的治疗效果。
使用高脂饮食联合STZ注射诱导Wistar大鼠DPN模型；使用高糖（150 mM葡萄糖）处理RSC96施万细胞建立高糖损伤模型。
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复方芪英颗粒通过抑制内质网应激和凋亡减轻糖尿病周围神经病变
Compound Qiying Granules alleviates diabetic peripheral neuropathy by inhibiting endoplasmic reticulum stress and apoptosis.
实验完整度
高包含动物模型（STZ诱导DPN大鼠）和细胞模型（高糖诱导RSC96细胞），结合蛋白质组学、形态学、功能与机制验证。
主要模型
STZ诱导的DPN大鼠模型 高糖诱导的RSC96施万细胞模型 Wistar大鼠
重点核对
大鼠模型：8周龄雄性Wistar大鼠，高脂饮食8周后腹腔注射STZ 30 mg/kg两次，血糖≥11.1 mmol/L为DM模型，神经传导速度减慢>11%为DPN模型 细胞模型：RSC96细胞用150 mM葡萄糖处理24小时建立高糖模型 药物处理：CQYG低、中、高剂量分别为1.17、2.34、4.68 g/(kg·d)，灌胃给药，连续4周；细胞实验CQYG浓度分别为0.01、0.05、0.1 mg/ml预处理24小时 阳性对照：TMAO（化学伴侣）110 mg/(kg·d)灌胃；细胞实验5 mM 检测指标：坐骨神经形态、凋亡、氧化应激、ER应激和凋亡蛋白表达
摘要
背景：糖尿病周围神经病变（DPN）是糖尿病的主要并发症。本研究旨在探讨复方芪英颗粒（CQYG）对DPN的治疗效果及分子机制。方法：建立DPN大鼠模型和RSC96细胞模型，以评估CQYG的治疗效果。然后检测坐骨神经的形态和凋亡变化。进一步，采用基于串联质量标签的定量蛋白质组学技术鉴定差异表达蛋白（DEPs）及其潜在分子机制。同时检测关键信号通路的蛋白表达。结果：CQYG治疗显著改善了DPN大鼠的血糖和氧化应激水平，并进一步减少了神经纤维髓鞘病变、去神经支配和细胞凋亡。此外，在CQYG治疗的DPN大鼠中发现了2176个DEPs。富集分析显示，内质网（ER）中的蛋白质加工和凋亡在CQYG治疗后均受到抑制。接下来，CQYG治疗降低了高糖诱导的RSC96细胞中炎症因子的表达、线粒体损伤和细胞凋亡。透射电子显微镜结果显示，CQYG治疗改善了神经髓鞘、线粒体和内质网的形态。CQYG治疗降低了DPN模型中高表达的内质网应激和凋亡通路蛋白。此外，我们还预测了CQYG在DEPs中的潜在靶点。结论：CQYG通过抗内质网应激和抗凋亡在实验性糖尿病神经病变中发挥神经保护作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 复方芪英颗粒（CQYG）对糖尿病周围神经病变（DPN）是否具有治疗作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- CQYG通过抑制内质网应激（PERK通路）和凋亡发挥神经保护作用。
- 主要证据
- 在DPN大鼠和高糖诱导的RSC96细胞中，CQYG改善神经纤维髓鞘病变、减少细胞凋亡，并下调PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、Bax等ER应激和凋亡蛋白的表达。
- 研究意义
- 研究表明CQYG可能是治疗DPN的一种潜在策略，为开发改善DPN的治疗方案提供了新途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CQYG治疗及分组
观察不同剂量CQYG对DPN模型的影响，并与阳性对照TMAO比较。
将DPN大鼠随机分为DPN模型组、CQYG低、中、高剂量组和TMAO组，连续灌胃给药4周；细胞实验分为对照组、高糖组、CQYG低、中、高剂量组和TMAO组。
评估大鼠神经功能和病理变化
检测CQYG对DPN大鼠感觉功能和坐骨神经病理损伤的改善作用。
通过热板实验和机械痛觉实验评估感觉功能；HE染色和LFB染色观察神经纤维病理；TUNEL染色检测细胞凋亡；透射电镜观察超微结构。
检测氧化应激和炎症指标
评估CQYG对DPN相关氧化应激和炎症的调节作用。
检测大鼠血清中Glu、MDA、SOD、CAT、GSH、NO含量；检测RSC96细胞培养上清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。
蛋白质组学分析鉴定差异表达蛋白
鉴定CQYG治疗前后DPN大鼠坐骨神经中的差异表达蛋白及富集通路。
采用TMT标记定量蛋白质组学分析三组坐骨神经样本，通过生信分析（GSEA、WGCNA、GSVA）筛选关键蛋白和通路。
验证ER应激和凋亡通路蛋白表达
验证CQYG对ER应激和凋亡相关蛋白表达的影响。
通过Western blot检测大鼠坐骨神经和RSC96细胞中PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、Bax、IGF-1等蛋白的表达。
网络药理学预测CQYG靶点
预测CQYG活性成分在ER应激和凋亡通路中的潜在靶蛋白。
使用TCMSP数据库预测CQYG成分的靶蛋白，与差异表达蛋白取交集，并进行通路富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | 链脲佐菌素 | -- | -- |
| 动物实验 | 复方芪英颗粒 | -- | -- |
| 行为学测试 | von Frey纤维丝 | -- | -- |
| 组织学染色 | 固蓝 | servicebio | -- |
| 凋亡检测 | ApopTag荧光原位凋亡检测试剂盒 | Chemicon | -- |
| 生化检测 | 葡萄糖检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | -- |
| 丙二醛检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | -- | |
| 超氧化物歧化酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | -- | |
| 过氧化氢酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | -- | |
| 谷胱甘肽检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | -- | |
| 一氧化氮检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | -- | |
| 蛋白质组学 | BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| TMT标记试剂 | Thermo Scientific | -- | |
| 高pH反相肽段分级试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| MASCOT引擎 | Matrix Science | -- | |
| Proteome Discoverer 1.4软件 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素和链霉素 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | TransGen | -- |
| 炎症因子检测 | IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA试剂盒 | MULTI sciences | -- |
| 流式分析 | 二氢乙啶 | Biosharp | -- |
| JC-1染料 | Biosharp | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V PE/7AAD凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| 抗β-actin抗体 | SinoBiological | 100166-MM10 | |
| 抗GRP78抗体 | CST | 3183S | |
| 抗PERK抗体 | CST | 3192S | |
| 抗p-PERK抗体 | CST | 3179S | |
| 抗ATF4抗体 | CST | 11815S | |
| 抗Bax抗体 | CST | 2772T | |
| 抗IGF-1抗体 | Abcam | ab223567 | |
| 抗CHOP抗体 | CST | 2895S | |
| HRP标记的二抗（山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG） | Abcam | ab205719, ab205718 | |
| 增强化学发光试剂盒 | -- | -- | |
| 凝胶成像系统 | BioRad | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism 9.3.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 大鼠品系、性别、年龄、体重；高脂饮食时长；STZ剂量、注射次数和途径；血糖阈值；神经传导速度减慢标准；对照组处理 阅读提示：Materials and methods: Experimental animals and models |
| 药物干预 | CQYG剂量（低、中、高）和给药方式；TMAO剂量；给药起始时间、持续时间和频率；对照组设置 阅读提示：Materials and methods: Treatment |
| 细胞模型 | 细胞系（RSC96）；培养条件（DMEM高糖、FBS浓度、抗生素）；高糖浓度和处理时间；CQYG预处理浓度和时间；TMAO浓度；分组设置 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and treatment |
| 功能检测 | von Frey测试和热板测试环境参数（笼子尺寸、温度、时间）；反应时间记录方法 阅读提示：Materials and methods: Behavioral test |
| 病理形态学 | 组织固定方法（甲醛或戊二醛）；切片厚度；染色方法（HE、LFB、TUNEL）及试剂品牌；电镜样品处理步骤（锇酸固定、脱水、包埋、切片厚度、染色） 阅读提示：Materials and methods: HE and luxol fast blue staining, TUNEL staining, Transmission electron microscopy |
| 生化指标检测 | 检测指标（Glu、MDA、SOD、CAT、GSH、NO）；试剂盒品牌；样本类型（血清） 阅读提示：Materials and methods: Biochemical indexes detection |
| 蛋白质组学分析 | 样本数量（每组3个）；蛋白提取方法；酶解条件；TMT标记试剂；LC-MS/MS参数（仪器、色谱柱、梯度、扫描参数）；数据处理软件；差异蛋白筛选阈值（P<0.05） 阅读提示：Materials and methods: TMT labeling, LC-MS/MS analysis, Bioinformatic analysis |
| 蛋白表达验证 | 裂解液成分；抗体来源、稀释比；内参（β-actin）；显色方法；图像分析 阅读提示：Materials and methods: Western blot |