验证DIO小鼠肝脏中Mof表达下调
确定Mof在NAFLD模型中的表达变化
通过Western blot、IHC和IF检测DIO小鼠肝脏中Mof和H4K16ac表达，并分析Mof启动子表观修饰。
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- 移动端
Mof在健康或非酒精性脂肪肝条件下对肝脏脂质代谢发挥不同作用
Mof plays distinct roles in hepatic lipid metabolism under healthy or non-alcoholic fatty liver conditions.
实验完整度
高包含体内外模型：Mof敲除小鼠、细胞系、DIO小鼠，并进行了功能验证（脂质积累）及机制验证（PPARα乙酰化、mTOR通路）。
主要模型
Mof flox/flox; ERT-Cre+小鼠（4-OHT诱导Mof缺陷） AML12小鼠肝细胞系 饮食诱导肥胖（DIO）小鼠模型 野生型C57BL/6J小鼠
重点核对
Mof表达下调与NAFLD进展相关（GSE126848） Mof敲除或mg149抑制导致PPARα表达下降 PA处理下mg149降低p-mTOR/mTOR水平 mg149改善DIO小鼠肝内TG积累和糖耐量 PPARα K257和K232为Mof乙酰化靶点
摘要
生理学；分子生物学；细胞生物学
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Mof在健康和NAFLD条件下对肝脏脂质代谢的作用及机制是什么？
- 核心机制
- 在正常条件下，Mof通过乙酰化PPARα并维持其表达促进脂质代谢；在NAFLD条件下，Mof通过Tnk2-Akt-mTOR通路调节mTOR磷酸化，抑制Mof可改善脂质代谢。
- 主要证据
- Mof缺陷小鼠和mg149处理的细胞显示脂质积累增加和PPARα降低；PA处理的细胞和DIO小鼠中，mg149降低p-mTOR/mTOR并减少肝内TG；Co-IP和质谱鉴定PPARα乙酰化位点。
- 研究意义
- Mof抑制可能成为治疗肝脏脂质代谢紊乱的潜在靶点，并可能阻断肥胖向NAFLD和糖尿病的进展。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析Mof表达与人类NAFLD及脂质代谢的关系
探究Mof在人类NAFLD中的表达及其对脂质代谢基因的调控
利用GSE126848和GSE106369数据集进行转录组分析，比较KAT8 mRNA水平，分析差异表达基因和KEGG通路。
构建Mof缺陷小鼠并分析代谢表型
验证Mof对肝脏脂质代谢的体内影响
使用4-OHT诱导Mof flox/flox; ERT-Cre+小鼠Mof缺失，检测血清和肝内TG、胆固醇、丙氨酸、ALT，并进行Oil-O和PAS染色。
体外实验：mg149处理AML12细胞
阐明Mof抑制对正常和PA处理细胞脂质代谢的影响
用mg149处理AML12细胞，检测脂质积累、PPARα表达和mTOR磷酸化。
机制研究：Mof调控PPARα乙酰化
证实PPARα是Mof的非组蛋白靶点
通过Co-IP检测Mof与PPARα相互作用，质谱鉴定乙酰化位点，并验证mg149对PPARα乙酰化及下游基因表达的影响。
体内验证：mg149对野生型小鼠肝脏代谢的影响
验证Mof抑制在正常小鼠中的代谢效应
给WT小鼠注射mg149，检测葡萄糖耐量、胰岛素耐量、肝内脂质和糖原。
体内验证：mg149对DIO小鼠肝脏代谢的影响
评估Mof抑制在NAFLD模型中的治疗潜力
给DIO小鼠注射mg149，检测代谢指标、组织学变化、mTOR信号通路及代谢组学。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | AML12专用培养基 | Procell | CM-0602 |
| 0.25%胰蛋白酶（含酚红） | Gibco | 15050057 | |
| 药物处理 | MG149 | Selleck | S7476 |
| Wy-14643 | MedChemExpress | HY-16995 | |
| 棕榈酸 | Kunchuang biotechnology | SYSJ-KJ003 | |
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 动物实验 | 无水葡萄糖 | MACKLIN | G6172 |
| 人胰岛素注射液 | Wanbang Biopharmaceuticals | 41-1031A | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 18324020 |
| Opti-MEM I减血清培养基 | Gibco | 2323655 | |
| 染色 | PAS染色试剂盒 | Solarbio | G1281 |
| 油红O染色试剂盒（培养细胞） | Solarbio | G1262 | |
| 改良油红O染色试剂盒 | Solarbio | G1261 | |
| 免疫组化 | DAB检测试剂盒 | Gene Tech Company Limited | GK60050 |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Beyotime | C1006 |
| 罗丹明标记山羊抗兔IgG | ZSGB-BIO | ZF-0316 | |
| Western blot | Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | WBKLS0500 |
| Immobilon-FL PVDF膜 | Millipore | IPFL85R | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| ELISA | 小鼠丙氨酸ELISA试剂盒 | Research Cloud Biology | KYY-46176M1 |
| 生化检测 | 丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C009-2-1 |
| 天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C010-2-1 | |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 | |
| 总胆固醇检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | F002-1-1 | |
| 肝/肌糖原检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A043-1-1 | |
| RNA提取 | E.Z.N.A总RNA提取试剂盒I | Omega BIO-TEK | R6834-01 |
| RT-qPCR | Evo M-MLV反转录试剂盒（含gDNA清除） | Accurate Biology | AG11705 |
| SYBR Green预混液qPCR试剂盒 | Accurate Biology | AG11701 | |
| ChIP | SimpleChIP Plus试剂盒（磁珠法） | Cell Signaling Technology | 38191S |
| SimpleChIP通用qPCR预混液 | Cell Signaling Technology | 88989P | |
| Co-IP | Pierce经典磁性IP/Co-IP试剂盒 | Thermo Scientific | 88804 |
| 抗体 | 兔单克隆抗Mof抗体 | Abcam | ab200660 |
| 兔单克隆抗LC3抗体 | Abcam | ab192890 | |
| 兔单克隆抗p62抗体 | Abcam | ab109012 | |
| 兔单克隆抗Atg7抗体 | Abcam | ab52472 | |
| GAPDH抗体 | Abways | AB0037 | |
| 兔单克隆抗Akt（pan）抗体 | Cell Signaling Technology | 4691S | |
| 兔单克隆抗磷酸化Akt (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060S | |
| 兔单克隆抗乙酰化组蛋白H4（Lys16）抗体 | Cell Signaling Technology | 13534S | |
| 兔抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2972S | |
| 兔单克隆抗磷酸化mTOR (Ser2448)抗体 | Cell Signaling Technology | 5536S | |
| 兔单克隆抗三甲基化组蛋白H3（Lys27）抗体 | Cell Signaling Technology | 9733S | |
| 兔单克隆抗三甲基化组蛋白H3（Lys4）抗体 | Cell Signaling Technology | 9751S | |
| 兔单克隆抗乙酰化组蛋白H3（Lys27）抗体 | Cell Signaling Technology | 8173S | |
| 兔单克隆抗乙酰化组蛋白H3（Lys9）抗体 | Cell Signaling Technology | 9649T | |
| 乙酰化组蛋白H3（Lys23）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 14932S | |
| 兔抗乙酰化组蛋白H2B（Lys20）抗体 | Cell Signaling Technology | 2571S | |
| 兔抗乙酰化组蛋白H2B（Lys5）抗体 | Cell Signaling Technology | 2574S | |
| 兔抗乙酰化组蛋白H3（Lys18）抗体 | Cell Signaling Technology | 9675T | |
| 兔抗乙酰化赖氨酸抗体 | Cell Signaling Technology | 9441S | |
| 兔单克隆抗H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499S | |
| 小鼠单克隆抗兔IgG（构象特异性） | Cell Signaling Technology | 3678S | |
| 小鼠单克隆抗ACK抗体（A-11） | Santa Cruz Biotechnology | sc-28336 | |
| 兔多克隆抗PPARα抗体 | Proteintech | 15540-1-AP | |
| PPARα抗体 | GeneTex | GTX101098 | |
| 小鼠单克隆抗磷酸化mTOR (Ser2448)抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 兔多克隆抗Cps1抗体 | Proteintech | 18703-1-AP | |
| 兔多克隆抗GCK抗体 | Proteintech | 19666-1-AP | |
| 兔多克隆抗组蛋白H4（乙酰化Lys8）抗体 | Immunoway | YK0012 | |
| CPT1A兔多克隆抗体 | Abclonal Technology | A5307 | |
| 辣根酶标记山羊抗兔IgG | ZSGB-BIO | ZB-2301 | |
| 辣根酶标记山羊抗小鼠IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | |
| 质谱分析 | Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY nLC 1200超高压液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 代谢组学 | Sciex TripleTOF 6600质谱仪 | Sciex | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、年龄、性别；DIO模型高脂饮食比例及持续时间；Mof敲除诱导方式（4-OHT剂量和时间） 阅读提示：Methods 'Experimental model and study participant details' 和 'Mice experiments' |
| 药物处理 | mg149剂量（1 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、频率（隔日）、溶剂（DMSO/Tween80/PEG300）；wy-14643浓度（10 μM） 阅读提示：Methods 'Mice experiments' 和 'Cell culture and treatment' |
| 细胞实验 | AML12细胞培养条件（专用培养基）；mg149浓度（35 nM）和处理时间（1天）；PA浓度（0.3 mM）和处理时间（24小时）；siRNA转染浓度（160 pmol） 阅读提示：Methods 'Cell culture and treatment' |
| 生化检测 | 血清和肝内TG、胆固醇、丙氨酸、ALT、AST测定方法及试剂盒；肝脏样品处理（称重、提取） 阅读提示：Methods 'ALT, AST, TG, cholesterol, and glycogen measurements' 和 'Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)' |
| 染色分析 | HE、PAS、Oil-O染色步骤及试剂盒；IHC和IF染色的一抗稀释比和抗原修复条件 阅读提示：Methods 'HE, PAS, and Oil-O staining' 和 'IHC and IF staining' |
| 蛋白检测 | Western blot一抗稀释比、二抗稀释比、PVDF膜型号；ChIP-qPCR抗体及引物序列 阅读提示：Methods 'Western blotting' 和 'ChIP and ChIP-qPCR' |