评估TFE3在肾癌细胞葡萄糖饥饿耐受中的作用
验证TFE3是否影响肾癌细胞对葡萄糖饥饿和GLUT1抑制的敏感性。
使用慢病毒介导的shRNA将TFE3敲低约50%，在葡萄糖饥饿（ACHN: 1 mM；Caki-1: 2 mM）或GLUT1抑制剂（BAY-876，1 μM）条件下培养细胞，通过细胞计数和集落形成实验检测细胞增殖。
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TFE3-SLC36A1轴促进肾癌细胞对葡萄糖饥饿的抵抗
TFE3-SLC36A1 axis promotes resistance to glucose starvation in kidney cancer cells.
实验完整度
高该研究包含体外细胞实验（葡萄糖饥饿、药物处理、基因敲低/敲除）、分子机制验证（O-GlcNAc糖基化、ChIP-Seq/RNA-Seq、回补实验）以及体内异种移植瘤模型。
主要模型
肾癌细胞系ACHN、Caki-1 人胚肾HEK-293T细胞 免疫缺陷小鼠异种移植瘤模型 配对肾癌患者组织样本
重点核对
葡萄糖饥饿浓度：ACHN为1 mM，Caki-1为2 mM，培养时间6天（增殖）或12-24小时（蛋白水平）。 TFE3敲低程度：使用shRNA将TFE3敲低至约50%（用于饥饿敏感性实验）或<20%（用于SLC36A1表达实验）。 GLUT1抑制剂BAY-876浓度：1 μM，处理时间24小时（蛋白水平）或6天（增殖）。 细胞计数实验中每组包含4个生物学重复，RT-qPCR每组至少3个技术重复，统计采用Welch's t检验或ANOVA。 异种移植实验接种1×10^6个ACHN细胞至裸鼠（Nu/Nu，4周龄，雄性）侧腹，每周测量肿瘤大小，约5周后处死。
摘要
对包括葡萄糖在内的营养物质的高需求是癌症的特征。“饥饿疗法”一直被用来抑制肿瘤进展。一种引人注目的方案是抑制癌细胞中的葡萄糖转运蛋白GLUT1。此外，在癌症进展过程中，癌细胞可能遭受葡萄糖供应不足。然而，癌细胞能以某种方式耐受葡萄糖饥饿。揭示其潜在机制将有助于理解癌症进展并有益于癌症治疗。TFE3是一种已知能激活自噬基因的转录因子。生理状态下TFE3的活性受磷酸化触发的核转位调控，以响应营养状态。我们最近报道，即使在营养充足条件下，TFE3也组成性定位于细胞核并促进肾癌细胞增殖。目前尚不清楚TFE3是否以及如何响应葡萄糖饥饿。在本研究中，我们通过将细胞暴露于生理相关浓度的葡萄糖，证明TFE3促进肾癌细胞对葡萄糖饥饿的抵抗。我们发现葡萄糖饥饿通过增加TFE3的O-GlcNAc糖基化来触发其蛋白稳定化。此外，通过一项无偏的功能基因组研究，我们确定SLC36A1（一种溶酶体氨基酸转运蛋白）是TFE3的靶基因，其对TFE3蛋白水平敏感。我们发现SLC36A1在肾癌中过表达，其促进mTOR活性和肾癌细胞增殖。重要的是，SLC36A1的水平通过TFE3被葡萄糖饥饿诱导，这增强了细胞对葡萄糖饥饿的抵抗。抑制TFE3或SLC36A1显著增加肾癌细胞对GLUT1抑制剂的敏感性。总之，我们发现了一个功能性的TFE3–SLC36A1轴，它响应葡萄糖饥饿并增强肾癌细胞的饥饿耐受。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TFE3是否以及如何影响肾癌细胞对葡萄糖饥饿的耐受？并鉴定其下游效应基因。
- 核心机制
- 葡萄糖饥饿通过增加TFE3的O-GlcNAc糖基化（主要发生在S560）来稳定TFE3蛋白，TFE3随后转录上调溶酶体氨基酸转运蛋白SLC36A1，进而维持mTOR活性并促进肾癌细胞增殖及饥饿耐受。
- 主要证据
- TFE3敲低（约50%）增强肾癌细胞对葡萄糖饥饿和GLUT1抑制的敏感性；葡萄糖饥饿和GLUT1抑制增加TFE3蛋白稳定性；O-GlcNAc糖基化增强TFE3稳定性，S560A突变消除该效应；ChIP-Seq和RNA-Seq鉴定SLC36A1为TFE3直接靶基因；SLC36A1在肾癌中高表达，敲低或敲除SLC36A1降低mTOR活性并抑制增殖及异种移植肿瘤生长。
- 研究意义
- 该研究揭示了TFE3–SLC36A1轴在肾癌细胞适应葡萄糖饥饿中的作用，为肾癌治疗（如联合GLUT1抑制剂）提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测葡萄糖饥饿对TFE3蛋白稳定性的影响
探究葡萄糖饥饿是否增加TFE3蛋白水平及其稳定性。
对肾癌细胞进行葡萄糖饥饿或GLUT1抑制（shRNA或BAY-876）处理，通过Western blot分析TFE3蛋白水平；使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）追踪TFE3蛋白稳定性。
验证TFE3 O-GlcNAc糖基化及其对稳定性的贡献
确定葡萄糖饥饿是否通过O-GlcNAc糖基化稳定TFE3。
使用OGA抑制剂TMG、OGA/OGT敲低改变O-GlcNAc水平；通过共表达TFE3与OGT进行免疫共沉淀（IP-WB）和体外O-GlcNAc糖基化实验验证TFE3的O-GlcNAc糖基化；通过质谱鉴定S560为修饰位点；引入S560A突变检测其对O-GlcNAc水平和蛋白稳定性的影响。
鉴定TFE3靶基因SLC36A1
寻找TFE3下游效应基因，特别是与mTOR和溶酶体功能相关的靶点。
对TFE3敲低（~50%）的Caki-1细胞进行RNA-Seq，并用ChIP-Seq（HA-TFE3）鉴定TFE3基因组结合位点；通过ChIP-qPCR、RT-qPCR和Western blot验证SLC36A1作为TFE3直接靶基因，并检测葡萄糖饥饿对SLC36A1表达的影响；通过TCGA数据分析SLC36A1与TFE3的相关性。
评估SLC36A1对肾癌细胞增殖和mTOR活性的影响
验证SLC36A1是否在肾癌中发挥促增殖作用并影响mTOR信号。
通过CRISPR-Cas9敲除SLC36A1并过表达SLC36A1，检测细胞增殖和集落形成；在免疫缺陷小鼠中接种SLC36A1-KO细胞进行异种移植实验；通过Western blot检测S6K磷酸化反映mTOR活性。
检测SLC36A1对葡萄糖饥饿耐受的作用
验证SLC36A1是否被TFE3诱导并参与饥饿耐受。
使用CRISPR-Cas13d敲低SLC36A1，在葡萄糖饥饿或GLUT1抑制条件下检测细胞增殖；在饥饿条件下评估SLC36A1敲除对mTOR活性的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | Procell | PM150710 |
| 最低必需培养基 | Procell | PM150410 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 12800-082 | |
| 胎牛血清 | PAN | ST30-3302 | |
| 无糖McCoy's 5A培养基 | Procell | PM150718 | |
| 无糖最低必需培养基 | Procell | PM150443 | |
| 无糖DMEM培养基 | Procell | PM150270 | |
| 药物处理 | MG132 | MedChemExpress | HY-13259 |
| BAY-876 | MedChemExpress | HY-100017 | |
| Thiamet-G (TMG) | MedChemExpress | HY-12588 | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 杀稻瘟菌素 | -- | -- | |
| G418 | MedChemExpress | HY-17561 | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0011 |
| 抗TFE3抗体 | Cell Signaling Technology | 14779 | |
| 抗TFEB抗体 | Cell Signaling Technology | 4240 | |
| 抗SLC36A1抗体 | Proteintech | 24775-1-AP | |
| 抗Myc标签抗体 | Proteintech | 16286-1-AP | |
| 抗p70 S6K抗体 | Proteintech | 14485-1-AP | |
| 抗磷酸化S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| 抗S6抗体 | Proteintech | 80208-1-RR | |
| 抗ATG3抗体 | Cell Signaling Technology | 3415 | |
| 抗OGT抗体 | Cell Signaling Technology | 24083 | |
| 抗OGA抗体 | Proteintech | 14711-1-AP | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abclonal | AC026 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abclonal | AC033 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Abclonal | 1791 | |
| HRP标记的抗FLAG抗体 | Sigma | A8592 | |
| 抗O-GlcNAc (CTD110.6)抗体 | Cell Signaling Technology | 9875 | |
| 抗磷酸化p70 S6K (Thr389)抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 | |
| 抗Glut1抗体 | Proteintech | 66290-1-Ig | |
| HRP标记的抗GST抗体 | Proteintech | HRP-66001 | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| HRP标记的山羊抗兔轻链特异二抗 | Jackson ImmunoResearch | 211-032-171 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠轻链特异二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115-035-174 | |
| ChemiDoc XRS+凝胶成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫荧光 | 明胶 | Sigma | G1890 |
| 抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| Alexa Fluor偶联二抗 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | |
| DAPI | -- | -- | |
| Fluoromount-G封片剂 | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| QImaging Retiga R6单色相机 | QImaging | -- | |
| Zeiss Axiovert A1荧光显微镜 | Zeiss | -- | |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | -- | -- |
| 异种移植实验 | 基质胶 | BD | 354248 |
| ChIP | 蛋白A/G磁珠 | MCE | HY-K0202 |
| PCR纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
| 免疫沉淀 | 微球菌核酸酶 | New England Biolabs | M0247SVIAL |
| 抗FLAG M2琼脂糖珠 | GeneScript | L00432-5 | |
| 蛋白A琼脂糖珠 | Cell Signaling Technology | 9863S | |
| 体外O-GlcNAc糖基化 | UDP-GlcNAc | Sigma | U4375 |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| 逆转录酶 | Toyobo | FSQ-101 | |
| SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q712-02 | |
| CFX connect实时PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 基因编辑 | pLenti-CRISPR-V2载体 | Addgene | 52961 |
| 质谱 | UltiMate 3000 RSLCnano液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| timeTOF Pro质谱仪 | Bruker | -- | |
| ChIP-Seq | Illumina测序文库构建试剂盒 | New England Biolabs | E7103 |
| NGS3K | PerkinElmer | -- | |
| NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| RNA-Seq | MGISEQ-2000RS测序平台 | BGI | -- |
| 葡萄糖浓度测量 | 血糖仪 | Sinocare | GA-3 |
| 生物信息学分析 | MaxQuant | -- | -- |
| FIJI | -- | -- | |
| GraphPad 8.0 | -- | -- | |
| R | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基配方、血清浓度、传代条件、培养温度与CO2浓度；药物剂量与时间；抗生素选择浓度。 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 葡萄糖饥饿 | 葡萄糖浓度（ACHN: 1 mM；Caki-1: 2 mM）、饥饿处理时间、培养基类型。 阅读提示：Methods: Glucose starvation |
| TFE3敲低 | shRNA序列、敲低效率（约50%或<20%）、慢病毒载体、感染和筛选条件。 阅读提示：Figure legends (Fig. 1A) 和 Methods（基因敲低） |
| Western blot | 抗体信息（品牌、货号、稀释度）、蛋白上样量（β-actin 20 μg，其他50 μg）、封闭条件、显色方法。 阅读提示：Methods: Western blot |
| 免疫沉淀体外O-GlcNAc分析 | IP抗体、缓冲液、清洗条件、体外反应体系（UDP-GlcNAc浓度、反应时间、温度）。 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation, In vitro O-GlcNAcylation |
| SLC36A1敲除/敲低 | CRISPR-Cas9 sgRNA序列、Cas13d sgRNA序列、敲除/敲低效率、载体和筛选条件。 阅读提示：Methods: Gene KO with CRISPR-Cas9 and KD with CRISPR-Cas13d，表S1 |
| 异种移植实验 | 小鼠品系（Nu/Nu，4周龄，雄性）、接种细胞数（1×10^6）、基质胶比例、肿瘤测量时间与体积计算公式。 阅读提示：Methods: Xenograft study |
| ChIP和qPCR | 固定条件、染色质片段化、抗体、洗涤缓冲液、qPCR引物、数据分析方法。 阅读提示：Methods: Chromatin immunoprecipitation and sequential ChIP |
| RNA-Seq和ChIP-Seq | 细胞处理（TFE3敲低）、建库试剂盒、测序平台（Illumina NovaSeq 6000, MGISEQ-2000RS）、数据分析参数。 阅读提示：Methods: Chromatin immunoprecipitation-Sequencing, RNA-Sequencing, Analysis of ChIP-Seq/Analysis of RNA-Seq |