Akkermansia muciniphila alleviates abdominal aortic aneurysms via restoring CITED2 activated by EPAS1.
包含细胞实验（VSMC、巨噬细胞）、动物模型（Ang II诱导AAA小鼠）及患者样本转录组数据（GSE197748）等多个独立证据层级，并进行功能验证（敲低/过表达）和机制验证（ChIP、双荧光素酶）。
Ang II诱导的腹主动脉瘤小鼠模型（ApoE-/-） 小鼠原代血管平滑肌细胞（VSMC） 小鼠巨噬细胞J774A.1细胞系
Am灌胃剂量：2×10^8 CFU/只/天，灌胃体积180μL Ang II处理：皮下注射1.44 mg/kg/day，持续28天 VSMC处理：Ang II 10μM处理48小时，丙酸10μg/mL处理5天 LPS诱导巨噬细胞炎症：100ng/mL处理2小时 实验分组：每组n=6只小鼠，细胞实验重复3次
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立Ang II诱导的小鼠AAA模型，并验证模型是否成功模拟AAA病理特征
8周龄ApoE-/-小鼠高脂饮食喂养8周，皮下注射Ang II（1.44 mg/kg/day）或PBS持续28天。通过多普勒超声检测腹主动脉直径，离体测量主动脉直径，HE染色观察主动脉病理，Masson染色观察胶原沉积，ELISA检测炎性因子（IL-6, TNF-α, IL-1β），Western blot检测VSMC收缩标志物（SM22, α-SMA）。
分析AAA小鼠与假手术小鼠肠道菌群差异，鉴定与AAA相关的核心菌种
收集各组小鼠粪便样本，提取DNA，扩增16s rRNA V3-V4区，进行Illumina MiSeq/HiSeq2500高通量测序，分析属水平和种水平菌群丰度差异。结果显示AAA小鼠粪便中Akkermansia属及Am种丰度显著降低。
评估Am对AAA小鼠的治疗效果
AAA小鼠在Ang II注射后，每天灌胃给予180μL PBS或2×10^8 CFU Am，持续28天。通过多普勒超声和离体测量评估主动脉扩张，TUNEL检测VSMC凋亡，HE和Masson染色观察组织病理，ELISA检测炎性因子，Western blot检测收缩标志物。
鉴定Am在AAA中可能调控的关键分子靶点
结合gutMGene数据库预测微生物-靶基因关系及GSE197748数据集中AAA差异表达基因，取交集得到16个基因，进行功能富集分析，构建PPI网络，RT-qPCR验证候选转录因子（EPAS1, STAT1, STAT4, EP300）在主动脉组织中的表达。同时分析Am代谢产物丙酸对EPAS1表达的影响。
验证EPAS1对VSMC凋亡、增殖和炎症反应的影响
在VSMC中转染EPAS1敲低质粒（KD-EPAS1）或对照（KD-NC），并用Ang II处理。通过流式细胞术检测凋亡，CCK-8检测细胞活力，ELISA检测炎性因子，Western blot检测凋亡相关蛋白（Bcl-2, cleaved-caspase-3）和收缩标志物。
验证EPAS1在体内对AAA进展的影响
通过尾静脉注射慢病毒包裹的EPAS1敲低质粒（KD-EPAS1）或对照（KD-NC），然后进行Ang II诱导和Am灌胃。通过多普勒超声和离体测量评估主动脉直径，HE和Masson染色观察病理，ELISA检测炎性因子，TUNEL检测凋亡，Western blot检测收缩标志物。
确定EPAS1下游靶基因并验证其直接调控关系
通过TRRUST数据库预测EPAS1的转录靶标，与GSE197748差异表达基因取交集，得到CITED2和RUNX2。用RT-qPCR验证CITED2和RUNX2的表达变化。通过ChIP实验验证EPAS1与CITED2启动子的结合，通过双荧光素酶报告基因实验验证EPAS1对CITED2启动子转录活性的影响。
验证CITED2过表达是否逆转EPAS1敲低对VSMC和AAA的影响
在VSMC中同时转染KD-EPAS1和OE-CITED2或OE-NC，用Ang II处理。通过流式检测凋亡，Western blot检测收缩标志物和凋亡蛋白。体内实验中，小鼠注射慢病毒包裹的OE-CITED2质粒（基于KD-EPAS1），然后进行Ang II诱导和Am灌胃，评估主动脉直径、病理、炎症和凋亡。
验证EPAS1/CITED2轴对巨噬细胞炎症反应和极化状态的影响
在J774A.1细胞中转染KD-EPAS1和OE-CITED2或对照，用LPS刺激。通过ELISA检测炎性因子（IL-6, TNF-α），Western blot检测极化标志物（iNOS, CD38, CD206, Arg1）。体内实验中，通过免疫荧光染色观察主动脉组织巨噬细胞浸润（F4/80），免疫组化检测极化标志物。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 血管紧张素II | Sigma-Aldrich | A9525 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 试剂处理 | 脂多糖 | MedChemExpress | HY-D1056 |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 |
| 组织染色 | HE染色试剂盒 | Solarbio | G1120 |
| Masson染色试剂盒 | Solarbio | G1340 | |
| ELISA | 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Abcam | ab222503 |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Abcam | ab229393 | |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | R&D Systems | MLB00C | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Sangon | C503021 | |
| 抗SM22抗体 | GeneTex | GTX636672 | |
| 抗α-SMA抗体 | Cell Signaling Technologies | 19245 | |
| 抗Bcl-2抗体 | Abcam | ab182858 | |
| 抗cleaved-caspase-3抗体 | Cell Signaling Technologies | 9661S | |
| 抗iNOS抗体 | Abcam | ab283655 | |
| 抗CD38抗体 | Cell Signaling Technologies | 68336S | |
| 抗CD206抗体 | Abcam | ab64693 | |
| 抗Arg1抗体 | GeneTex | GTX109242 | |
| 抗β-tubulin抗体 | Abcam | ab179511 | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Abcam | ab205718 | |
| 凋亡检测 | Annexin V凋亡检测试剂盒 | Sangon | E606336 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Sangon | E606335 |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Thermo Fisher | 15596026CN |
| RT-qPCR | TaqMan逆转录试剂 | Thermo Fisher | N8080234 |
| ABsolute qPCR SYBR Green预混液 | Thermo Fisher | AB1285B | |
| ChIP | BeyoChIP ChIP检测试剂盒 | Beyotime | P2080S |
| 抗EPAS1抗体 | Cell Signaling Technologies | 57921S | |
| 同型对照IgG | Cell Signaling Technologies | 2729S | |
| 双荧光素酶报告基因 | pGL3-basic荧光素酶质粒 | Promega | -- |
| TUNEL | TUNEL试剂盒 | Beyotime | C1091 |
| 免疫荧光 | 免疫荧光染色试剂盒 | Beyotime | P0176 |
| 抗F4/80抗体 | Abcam | ab300421 | |
| 免疫组化 | 抗iNOS抗体 | Abcam | ab283655 |
| 抗CD38抗体 | Cell Signaling Technologies | 68336S | |
| 抗CD206抗体 | Abcam | ab64693 | |
| 抗Arg1抗体 | GeneTex | GTX109242 | |
| 生物素标记的山羊抗兔IgG | Solarbio | SHB134 | |
| 仪器 | 多普勒超声成像系统 | Mindray | DC-30 |
| 动物实验 | 嗜黏蛋白阿克曼菌 | American Type Culture Collection | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系（ApoE-/-）、周龄（8周）、饮食（高脂饲料含0.25%胆固醇和15%可可脂）、Ang II剂量（1.44 mg/kg/day）及给药途径（皮下注射） 阅读提示：Materials and Methods - Mice |
| Am灌胃 | Am菌株来源（ATCC）、培养条件（BHI培养基含1‰半胱氨酸，37°C厌氧48小时）、灌胃剂量（2×10^8 CFU/只/天）和体积（180μL） 阅读提示：Materials and Methods - Mice |
| 细胞实验 | VSMC来源（Procell）、培养条件（DMEM+10% FBS+双抗）、Ang II处理浓度（10μM）和时间（48小时）、丙酸浓度（10μg/mL）和时间（5天） 阅读提示：Materials and Methods - Culture and treatment of primary VSMC and J774A.1 cells |
| 巨噬细胞炎症 | J774A.1细胞来源（Procell）、LPS浓度（100ng/mL）和刺激时间（2小时） 阅读提示：Materials and Methods - Culture and treatment of primary VSMC and J774A.1 cells |
| 敲低和过表达 | 转染试剂（Lipofectamine 2000）及用量、质粒名称（KD-EPAS1、OE-CITED2）、转染时间（48小时） 阅读提示：Materials and Methods - Culture and treatment of primary VSMC and J774A.1 cells |
