构建AD小鼠模型并分组处理
建立DNCB诱导的AD样皮肤损伤模型，并评估LECT2处理或基因敲除对AD表现的影响。
使用C57BL/6背景的WT和LECT2 KO小鼠，通过背部皮肤涂抹DNCB（1%致敏两次，0.5%激发六次）建立AD模型，并皮下注射LECT2或PBS。
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LECT2在特应性皮炎恶化中的作用：基于体内和体外模型通过NF-κB信号通路的见解
Role of LECT2 in exacerbating atopic dermatitis: insight from in vivo and in vitro models via NF-κB signaling pathway.
实验完整度
高包含DNCB诱导的小鼠AD模型、TNF-α/IFN-γ诱导的HaCaT细胞模型，以及组织学、免疫组化、RT-qPCR、ELISA、Western Blot和免疫荧光等手段，涵盖体内外功能验证和机制验证。
主要模型
DNCB诱导的特应性皮炎小鼠模型（C57BL/6背景） LECT2基因敲除小鼠（C57BL/6背景） TNF-α/IFN-γ诱导的HaCaT细胞模型
重点核对
小鼠模型中使用1%和0.5% DNCB（溶剂为丙酮和橄榄油3:1）进行致敏和激发 LECT2皮下注射剂量为6 mg（溶于200 μL PBS），每次注射 HaCaT细胞模型使用TNF-α和IFN-γ各10 ng/mL处理24小时 LECT2处理浓度：细胞实验为400 ng/mL，处理时间分别为1小时（RT-qPCR）和24小时（Western Blot/ELISA） 动物分组包括PBS组、AD组（DNCB+PBS）、ADL组（DNCB+LECT2），每组包含6只WT和6只KO小鼠
摘要
白细胞细胞衍生趋化因子2（LECT2）与多种免疫疾病相关。先前我们报道了特应性皮炎（AD）患者血清LECT2水平与疾病严重程度相关。为了研究LECT2在AD中的作用并阐明其潜在机制，我们使用LECT2处理由1-氯-2,4-二硝基苯（DNCB）诱导的LECT2敲除（KO）和野生型（WT）小鼠AD模型，以及使用TNF-α/IFN-γ诱导的HaCaT细胞AD细胞模型。通过组织学、免疫组织化学、RT-qPCR、ELISA和Western Blot分析炎症因子和屏障蛋白。通过Western Blot和免疫荧光评估NF-κB信号通路的激活。在AD小鼠模型中，LECT2处理增加了表皮和真皮厚度、肥大细胞浸润，并下调了屏障蛋白。皮肤病变和血清中的炎症因子增加。在AD细胞模型中，LECT2降低了屏障蛋白水平并增加了炎症因子水平，增强了NF-κB P65核转位。这些结果表明，LECT2通过失调NF-κB信号通路加剧AD样反应，突出了其作为AD管理潜在治疗靶点的可能性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LECT2在特应性皮炎（AD）中的具体作用及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- LECT2通过激活NF-κB信号通路（增加IKBα和P65的磷酸化，促进P65核转位）来加重AD症状，降低屏障蛋白表达并增加炎症因子水平。
- 主要证据
- 在DNCB诱导的小鼠AD模型中，LECT2处理增加了表皮和真皮厚度、肥大细胞浸润、炎症因子水平，并降低FLG、IVL和LOR表达；在TNF-α/IFN-γ诱导的HaCaT细胞中，LECT2进一步降低屏障蛋白并增加炎症因子，并增强NF-κB P65核转位，通过Western Blot和免疫荧光验证。
- 研究意义
- 研究表明LECT2可能作为AD的潜在治疗靶点，为AD管理提供新的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测皮肤病理变化和肥大细胞浸润
评估LECT2对AD小鼠皮肤表皮和真皮厚度以及肥大细胞浸润的影响。
通过H&E染色测量表皮和真皮厚度，通过甲苯胺蓝染色计数肥大细胞。
分析屏障蛋白和炎症因子表达
评估LECT2对AD小鼠皮肤屏障蛋白（FLG、IVL、LOR）和炎症因子（IL-1β、IL-4）表达的影响。
通过免疫组化和Western Blot检测皮肤组织中FLG、IVL、LOR、IL-1β和IL-4的表达。
检测血清和皮肤组织中炎症因子水平
评估LECT2对AD小鼠血清和皮肤组织中炎症因子的影响。
通过RT-qPCR检测皮肤组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-13、TSLP、RANTES的mRNA水平；通过ELISA检测血清中TNF-α、IgE、组胺、IL-4、IL-13的蛋白水平。
构建AD细胞模型并检测炎症因子和屏障蛋白
在体外评估LECT2对TNF-α/IFN-γ诱导的HaCaT细胞中炎症因子和屏障蛋白表达的影响。
使用TNF-α和IFN-γ诱导HaCaT细胞建立AD细胞模型，用LECT2处理，然后通过RT-qPCR、ELISA和Western Blot检测炎症因子和屏障蛋白水平。
检测NF-κB信号通路激活
探究LECT2是否通过激活NF-κB信号通路发挥作用。
通过Western Blot检测总蛋白中p-IKBα/IKBα、p-P65/P65的比例，以及细胞质和细胞核中P65的水平；通过免疫荧光观察P65核转位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 重组小鼠LECT2 | CUSABIO Bioengineering Co., Ltd. | CSB-YP012855MO |
| 细胞培养 | HaCaT细胞 | Pricella Biotechnology Co., Ltd. | CL-0090 |
| 重组人LECT2 | R&D Systems, Inc. | 9908-LC | |
| 肿瘤坏死因子-α | PeproTech | 021825 | |
| 干扰素-γ | PeproTech | 091927 | |
| 组织学 | 甲苯胺蓝 | Solarbio | G3670 |
| 冰冻切片机 | Leica | CM1860 | |
| 显微镜 | Leica | DM | |
| iSolution软件 | IMT i-Solution Inc. | Version | |
| 免疫组织化学 | 抗Involucrin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21748 |
| 抗Loricrin抗体 | ProteinTech | 55439-1-AP | |
| 抗IL-1β抗体 | Affinity biosciences | AF5103 | |
| 抗IL-4抗体 | Affinity biosciences | AF5142 | |
| HRP标记二抗 | ProteinTech | -- | |
| RT-qPCR | 通用RNA提取试剂盒 | TaKaRa | 9767 |
| NanoDrop One分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 反转录预混液 | TaKaRa | RR036A | |
| Tli RNaseH Plus | TaKaRa | RR820A | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche Diagnostics | -- | |
| ELISA | 小鼠IgE ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M3034 |
| 小鼠组胺ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-0032c | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | ProteinTech | KE10002 | |
| 小鼠IL-4 ELISA试剂盒 | ProteinTech | KE10010 | |
| 小鼠IL-13 ELISA试剂盒 | ProteinTech | KE10021 | |
| 人IL-1β ELISA试剂盒 | ProteinTech | KE00021 | |
| 人IL-4 ELISA试剂盒 | ProteinTech | KE00016 | |
| 人IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H6156 | |
| 人IL-13 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0104 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 细胞质和核蛋白提取试剂盒 | Beyotime | P0027 | |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Beyotime | P1045 | |
| Mini-PROTEAN Tetra垂直电泳系统 | Bio-Rad | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| QuickBlock™ Western封闭液 | Beyotime | P0252 | |
| 抗GAPDH抗体 | ProteinTech | 60004-1-Ig | |
| 抗PCNA抗体 | ProteinTech | 60097-1-Ig | |
| 抗Filaggrin抗体 | GeneTex | GTX23137 | |
| 抗Involucrin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21748 | |
| 抗Loricrin抗体 | ProteinTech | 55439-1-AP | |
| 抗NF-κB P65抗体 | Abcam | ab32536 | |
| 抗NF-κB p-P65抗体 | Abcam | ab76302 | |
| 抗IKBα抗体 | Abcam | ab32518 | |
| 抗p-IKBα抗体 | Abcam | ab133462 | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | 1705061 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| Image J软件 | National Institutes of Health | Version | |
| 免疫荧光 | 激光共聚焦培养皿 | Solarbio | YA0572 |
| Triton X-100 | Solarbio | P1080 | |
| 牛血清白蛋白 | Solarbio | A8020 | |
| Cy3标记二抗 | ProteinTech | SA00009-2 | |
| DAPI工作液 | Solarbio | C0065 | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Nexcope | NCF950 | |
| 数据分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software Inc. | Version |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物实验 | 小鼠品系、周龄、体重、分组、DNCB浓度及给药方式、LECT2剂量和给药途径 阅读提示：Materials and methods 4.1和4.2 |
| 细胞实验 | 细胞系、培养条件、TNF-α/IFN-γ浓度和处理时间、LECT2浓度和处理时间、分组 阅读提示：Materials and methods 4.3和4.4，Figure legends 4和5 |
| 组织学分析 | 固定、脱水、包埋、切片厚度、染色方法、图像采集和分析参数 阅读提示：Materials and methods 4.5 |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒、逆转录体系、qPCR试剂、引物序列、内参基因、计算方法 阅读提示：Materials and methods 4.6 |
| ELISA | 血清和细胞培养上清的采集、ELISA试剂盒型号、检测步骤 阅读提示：Materials and methods 4.7 |
| Western blot | 蛋白提取方法、上样量、抗体稀释比例、内参蛋白、显影方法 阅读提示：Materials and methods 4.8 |
| 免疫荧光 | 细胞密度、固定、透化、封闭、抗体孵育、成像参数 阅读提示：Materials and methods 4.9 |