PRNP是泛癌预后标志物,并与结直肠癌中的EMT相关

PRNP is a pan-cancer prognostic and immunity-related to EMT in colorectal cancer.

作者信息Haifeng Chen, Yao Du, Zhiyuan Kong, Xinghe Liao, Weiping Li
PMID39170916
发布时间2024-08-05
DOI10.3389/fcell.2024.1391873

实验完整度

中

主要包括泛癌生物信息学分析和CRC细胞系体外功能实验,缺少动物模型或临床样本的体内验证,机制研究仅限于EMT相关蛋白表达变化。

主要模型

HCT116人结直肠癌细胞系 HT29人结直肠癌细胞系 TCGA泛癌数据队列

重点核对

PRNP在HCT116和HT29细胞中的敲低和过表达效率(通过Western blot验证,效率>80%) 细胞培养条件:McCoy's 5A培养基,10%FBS,100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素,37°C,5% CO2 CCK-8增殖实验检测时间点:6、12、24小时 伤口愈合实验迁移检测时间点:12、24小时,使用Ara-C(0.2 ug/mL) Transwell迁移和侵袭实验:接种细胞数(迁移80,000细胞;侵袭5×10^4细胞),培养时间24小时

摘要

背景:朊蛋白基因(PRNP)在多种组织中广泛表达。尽管PRNP在几种癌症中的作用已被研究,但尚无泛癌分析揭示其与肿瘤发生和免疫的关系。方法:对加州大学圣克鲁兹分校(UCSC)数据库中的癌症基因组图谱(TCGA)泛癌数据集进行了综合分析,以确定PRNP的表达及其潜在的预后意义。使用免疫浸润和富集分析方法来确定PRNP表达水平、肿瘤免疫和免疫治疗之间的相关性。此外,采用基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)方法检查涉及PRNP的可能信号通路。使用CCK-8实验、伤口愈合实验和Transwell实验进行体外实验,检测细胞朊蛋白(PrPC)对结直肠癌(CRC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响。通过蛋白质印迹检测上皮-间质转化(EMT)相关蛋白(N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、波形蛋白和Snail)的表达水平。结果:在大多数癌症类型中,PRNP高表达,这与患者的预后相关。PRNP表达与免疫浸润细胞、免疫抑制细胞浸润和免疫检查点分子密切相关。除肿瘤突变负荷(TMB)外,在几种癌症中还检测到PRNP表达与微卫星不稳定性(MSI)之间的显著相关性。体外细胞研究推测PrPC增强了CRC细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。结论:PRNP作为一种免疫相关的预后标志物,有望预测CRC免疫治疗的相关结果,同时促进细胞增殖、迁移和侵袭活动。此外,它可能在CRC中调控EMT过程中发挥作用。关键词:PRNP,泛癌,预后,免疫,EMT。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
PRNP在多种癌症中的表达及其与预后的关系,以及PRNP是否通过影响EMT促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
核心机制
PRNP(PrPC)通过调节EMT相关蛋白(上调N-cadherin、Vimentin和Snail,下调E-cadherin)促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
主要证据
基于TCGA泛癌数据,PRNP在多数癌症中高表达且与预后不良相关;在HCT116和HT29细胞中,敲低PRNP抑制增殖、迁移和侵袭,过表达则促进这些过程,并伴随EMT相关蛋白表达改变。
研究意义
PRNP可作为免疫相关的预后标志物,有望用于预测结直肠癌免疫治疗反应,并可能成为转移性结直肠癌的潜在治疗靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

泛癌表达和预后分析

评估PRNP在多种癌症中的表达水平及其与患者总生存期的关联。

使用TCGA泛癌数据集,通过log2(x+1)标准化,比较26种癌症类型中肿瘤与正常样本的PRNP表达,并进行Cox回归和Kaplan-Meier生存分析。

2

免疫浸润和免疫检查点分析

探讨PRNP表达与肿瘤免疫微环境、免疫细胞浸润及免疫检查点分子的相关性。

使用CIBERSORT、EPIC和TIMER算法评估免疫细胞浸润,并分析PRNP表达与60个免疫检查点基因、TMB和MSI的相关性。

3

富集分析

识别PRNP相关基因及其参与的生物学通路。

使用STRING构建PPI网络,筛选top10相关基因,进行GO和KEGG富集分析。

4

细胞培养和慢病毒转染

建立PRNP敲低和过表达的结直肠癌细胞模型。

HCT116和HT29细胞感染慢病毒(shRNA-PRNP或LV-PRNP),并设对照组,通过嘌呤霉素筛选,检测转染效率。

5

CCK-8增殖实验

检测PRNP表达水平对结直肠癌细胞增殖能力的影响。

将不同PRNP表达水平的细胞接种于96孔板,在不同时间点加入CCK-8溶液,测定490 nm吸光度。

6

迁移和侵袭实验

评估PRNP表达水平对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。

通过伤口愈合实验和Transwell实验(使用或不使用Matrigel)检测细胞迁移和侵袭能力。

7

Western blot检测EMT相关蛋白

检测PRNP表达水平对EMT相关蛋白表达的影响。

提取细胞蛋白,通过SDS-PAGE和蛋白质印迹检测N-cadherin、E-cadherin、Vimentin和Snail的表达,以β-actin为内参。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
McCoy's 5A培养基Procell Life Science & Technology Co., Ltd.--
胎牛血清Serana--
青霉素-链霉素Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.--
嘌呤霉素----
阿糖胞苷Ararat (Canton) Biotechnology Co., Ltd.--
PRNP过表达慢病毒Shanghai Nuobai Biotechnology Co., LtdNM_000311.5
靶向PRNP的shRNAShanghai Nuobai Biotechnology Co., LtdNM_000311.5
CCK-8试剂盒GlpBio--
Transwell小室Merck Millipore--
基质胶BD Bioscience--
PrPC抗体Proteintech12555-1-AP
N-钙黏蛋白抗体Affinity BiosciencesAF5239
E-钙黏蛋白抗体Affinity BiosciencesAF0131
波形蛋白抗体Affinity BiosciencesAF7013
Snail抗体Affinity BiosciencesAF6032
山羊抗兔IgG HRPProteintechSA00001-2
β-肌动蛋白抗体Proteintech20536-1-AP
ECL试剂盒Beyotime--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系来源、培养基成分、培养条件
阅读提示:见Methods 2.6 Cell culture
慢病毒转染
转染分组、MOI值、嘌呤霉素浓度、转染效率阈值
阅读提示:见Methods 2.7 Transfection of recombinant lentivirus
CCK-8增殖实验
细胞接种密度、检测时间点、CCK-8孵育时间和波长
阅读提示:见Methods 2.8 CCK-8 assay
迁移和侵袭实验
细胞接种数量、Ara-C浓度、下室FBS浓度、培养时间
阅读提示:见Methods 2.9 Wound healing assay和2.10 Cell migration and invasion assay
Western blot
抗体稀释比例、货号、内参选择
阅读提示:见Methods 2.11 Western blot analysis