泛癌表达和预后分析
评估PRNP在多种癌症中的表达水平及其与患者总生存期的关联。
使用TCGA泛癌数据集,通过log2(x+1)标准化,比较26种癌症类型中肿瘤与正常样本的PRNP表达,并进行Cox回归和Kaplan-Meier生存分析。
PRNP is a pan-cancer prognostic and immunity-related to EMT in colorectal cancer.
主要包括泛癌生物信息学分析和CRC细胞系体外功能实验,缺少动物模型或临床样本的体内验证,机制研究仅限于EMT相关蛋白表达变化。
HCT116人结直肠癌细胞系 HT29人结直肠癌细胞系 TCGA泛癌数据队列
PRNP在HCT116和HT29细胞中的敲低和过表达效率(通过Western blot验证,效率>80%) 细胞培养条件:McCoy's 5A培养基,10%FBS,100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素,37°C,5% CO2 CCK-8增殖实验检测时间点:6、12、24小时 伤口愈合实验迁移检测时间点:12、24小时,使用Ara-C(0.2 ug/mL) Transwell迁移和侵袭实验:接种细胞数(迁移80,000细胞;侵袭5×10^4细胞),培养时间24小时
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估PRNP在多种癌症中的表达水平及其与患者总生存期的关联。
使用TCGA泛癌数据集,通过log2(x+1)标准化,比较26种癌症类型中肿瘤与正常样本的PRNP表达,并进行Cox回归和Kaplan-Meier生存分析。
探讨PRNP表达与肿瘤免疫微环境、免疫细胞浸润及免疫检查点分子的相关性。
使用CIBERSORT、EPIC和TIMER算法评估免疫细胞浸润,并分析PRNP表达与60个免疫检查点基因、TMB和MSI的相关性。
识别PRNP相关基因及其参与的生物学通路。
使用STRING构建PPI网络,筛选top10相关基因,进行GO和KEGG富集分析。
建立PRNP敲低和过表达的结直肠癌细胞模型。
HCT116和HT29细胞感染慢病毒(shRNA-PRNP或LV-PRNP),并设对照组,通过嘌呤霉素筛选,检测转染效率。
检测PRNP表达水平对结直肠癌细胞增殖能力的影响。
将不同PRNP表达水平的细胞接种于96孔板,在不同时间点加入CCK-8溶液,测定490 nm吸光度。
评估PRNP表达水平对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。
通过伤口愈合实验和Transwell实验(使用或不使用Matrigel)检测细胞迁移和侵袭能力。
检测PRNP表达水平对EMT相关蛋白表达的影响。
提取细胞蛋白,通过SDS-PAGE和蛋白质印迹检测N-cadherin、E-cadherin、Vimentin和Snail的表达,以β-actin为内参。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | -- |
| 胎牛血清 | Serana | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 细胞处理 | 阿糖胞苷 | Ararat (Canton) Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 细胞转染 | PRNP过表达慢病毒 | Shanghai Nuobai Biotechnology Co., Ltd | NM_000311.5 |
| 靶向PRNP的shRNA | Shanghai Nuobai Biotechnology Co., Ltd | NM_000311.5 | |
| 细胞增殖实验 | CCK-8试剂盒 | GlpBio | -- |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Merck Millipore | -- |
| 基质胶 | BD Bioscience | -- | |
| Western blot | PrPC抗体 | Proteintech | 12555-1-AP |
| N-钙黏蛋白抗体 | Affinity Biosciences | AF5239 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | Affinity Biosciences | AF0131 | |
| 波形蛋白抗体 | Affinity Biosciences | AF7013 | |
| Snail抗体 | Affinity Biosciences | AF6032 | |
| 山羊抗兔IgG HRP | Proteintech | SA00001-2 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| ECL试剂盒 | Beyotime | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分、培养条件 阅读提示:见Methods 2.6 Cell culture |
| 慢病毒转染 | 转染分组、MOI值、嘌呤霉素浓度、转染效率阈值 阅读提示:见Methods 2.7 Transfection of recombinant lentivirus |
| CCK-8增殖实验 | 细胞接种密度、检测时间点、CCK-8孵育时间和波长 阅读提示:见Methods 2.8 CCK-8 assay |
| 迁移和侵袭实验 | 细胞接种数量、Ara-C浓度、下室FBS浓度、培养时间 阅读提示:见Methods 2.9 Wound healing assay和2.10 Cell migration and invasion assay |
| Western blot | 抗体稀释比例、货号、内参选择 阅读提示:见Methods 2.11 Western blot analysis |