化合物收集与ADMET筛选
筛选具有良好药代性质和口服生物利用度的潜在活性化合物。
从八个药材（白芍、当归、防风、甘草、黄芪、姜黄、羌活、生姜）收集1252个化合物，利用ADMETlab 2.0预测ADMET性质，根据Lipinski规则和补充条件筛选出274个潜在活性化合物。
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基于系统药理学和动物实验筛选蠲痹汤中抗类风湿关节炎的潜在活性化合物
Screening of potentially active compounds against rheumatoid arthritis in the Juan-Bi decoction using systems pharmacology and animal experiments.
实验完整度
高包含体外细胞实验（LPS诱导RAW.264.7细胞）和体内动物模型（CIA小鼠），并进行功能验证（细胞活力、NO产生、关节炎指数、组织学评分）及机制验证（Western blot、RT-qPCR）。
主要模型
LPS诱导的RAW264.7细胞 胶原诱导关节炎（CIA）DBA/1J小鼠模型
重点核对
LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型，LPS浓度1 μg/ml，处理24小时 CIA小鼠模型：DBA/1J雄性8周龄，牛II型胶原乳化于完全/不完全弗氏佐剂，第7天初次免疫，第28天加强免疫 BAC给药剂量：20 mg/kg（低）和40 mg/kg（高），每隔3天给药 MTX阳性对照：1 mg/kg，每隔3天给药 检测指标包括关节炎指数、micro-CT骨参数、H&E染色、番红O-固绿染色、Western blot和RT-qPCR
摘要
背景：蠲痹汤（JBD）是治疗类风湿关节炎（RA）的经典中药方剂。然而，JBD治疗RA的活性化合物仍不清楚。目的：本研究旨在利用系统药理学和实验方法筛选JBD中治疗RA的有效化合物。方法：从多个公共中药数据库中获取JBD中的药材和化合物。所有化合物首先通过吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）及理化性质进行初步筛选，然后进行靶点预测。从DisGeNet数据库获取RA病理基因。通过构建化合物-靶点-致病基因（C-T-P）网络并计算化合物对致病基因的累积相互作用强度，筛选潜在活性化合物。使用脂多糖（LPS）诱导的RAW.264.7细胞和胶原诱导关节炎（CIA）小鼠模型验证化合物的有效性。结果：我们筛选出JBD中治疗RA的15种潜在活性化合物。这些化合物主要作用于多种代谢途径、免疫途径和信号转导途径。此外，体内和体外实验表明，乙酸龙脑酯（BAC）通过抑制类固醇激素生物合成，减轻了关节损伤和炎症细胞浸润，并促进软骨表面光滑。结论：我们利用系统药理学方法筛选出JBD中治疗RA的潜在化合物。特别是，BAC具有抗风湿作用，未来需要研究阐明其潜在机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 蠲痹汤中哪些化合物具有治疗类风湿关节炎的潜在活性？
- 核心机制
- 乙酸龙脑酯通过抑制类固醇激素生物合成途径（下调CYP17A1、HSD17B3、TLR4表达及MAPK和p65磷酸化）缓解关节损伤。
- 主要证据
- 体外实验显示BAC降低LPS诱导RAW264.7细胞的NO产生和细胞活力；体内实验显示BAC降低CIA小鼠关节炎指数、骨表面/体积比，改善组织病理学评分，并下调CYP17A1、HSD17B3、TLR4蛋白和mRNA表达。
- 研究意义
- 为中药活性成分筛选提供方法学参考，并提示BAC作为RA治疗候选药物的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
靶点预测与C-T-P网络构建
预测活性化合物靶点并构建化合物-靶点-致病基因网络，以识别RA相关的重要靶点。
使用SEA、HitPickV2和SwissTargetPrediction预测靶点，从DisGeNet获取RA致病基因，结合BioGRID蛋白-蛋白相互作用数据构建C-T-P网络。
网络优化与活性化合物筛选
优化C-T-P网络，并基于累积相互作用强度筛选贡献度最高的化合物组合。
使用MOO模型优化网络，与degree、closeness、betweenness模型比较性能，并计算各化合物对致病基因的相互作用强度，筛选出累积强度达到90%的15个化合物。
体外抗炎活性验证
验证筛选化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响。
用CCK-8检测细胞活力，Griess试剂检测NO产生，ELISA检测IL-6、IL-1β、TNF-α分泌。
体内疗效验证
验证乙酸龙脑酯对CIA小鼠关节损伤的治疗作用。
建立CIA小鼠模型，给予MTX或不同剂量BAC，通过关节炎指数、micro-CT、组织学染色评估关节损伤程度。
机制验证
验证BAC对类固醇激素生物合成途径相关蛋白和基因表达的影响。
通过Western blot和RT-qPCR检测滑膜组织中CYP17A1、HSD17B3、TLR4、MAPK、p65的表达及磷酸化水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | -- | -- | |
| 细胞炎症模型建立 | 脂多糖 | Biosharp | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| 一氧化氮检测 | 格里斯试剂 | -- | -- |
| Synergy HT酶标仪 | Bio-Tek Instruments Inc. | -- | |
| 动物模型建立 | 牛II型胶原 | Chondrex, Inc. | -- |
| 完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 不完全弗氏佐剂 | -- | -- | |
| 甲氨蝶呤 | -- | -- | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解缓冲液 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗CYP17A1抗体 | Abcam | ab125022 | |
| 抗HSD17B3抗体 | Abcam | ab126228 | |
| 抗TLR4抗体 | Abcam | ab13556 | |
| 抗磷酸化MAPK抗体 | Affinity | AF4001 | |
| 抗MAPK抗体 | Affinity | BF8015 | |
| 抗磷酸化p65抗体 | SAB | 11011 | |
| 抗p65抗体 | SAB | 48676 | |
| HRP标记二抗 | -- | -- | |
| ECL蛋白质印迹试剂盒 | LabLead | E1050 | |
| 凝胶成像系统 | SINSAGE | ChampgelTM | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| AMV逆转录酶 | Qiagen | -- | |
| RNA酶抑制剂 | -- | -- | |
| oligo d(T)引物 | -- | -- | |
| Taq聚合酶 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞实验 | RAW264.7细胞来源（华南理工大学共享）、培养条件（DMEM+10%FBS+1%P/S，37°C，5%CO2）、LPS浓度（1 μg/ml）和处理时间（24小时）、化合物处理浓度（0-100 μM）和处理时间（24小时）。 阅读提示：Methods 2.12-2.14 |
| 动物模型建立 | CIA小鼠品系（DBA/1J，雄性，8周龄）、胶原来源和浓度（牛II型胶原2 mg/ml）、佐剂（完全/不完全弗氏佐剂）、免疫时间（第7天和第28天）、MTX剂量（1 mg/kg）和BAC剂量（20 mg/kg和40 mg/kg）及给药频率（每3天一次）、分组信息。 阅读提示：Methods 2.16 |
| 组织学分析 | 组织固定（4%多聚甲醛）、脱钙（10%EDTA）、染色方法（H&E和番红O-固绿）、评分标准（H&E评分和Mankin评分）。 阅读提示：Methods 2.17-2.18 |
| 分子检测 | 蛋白提取（RIPA缓冲液）、抗体品牌和货号、RT-qPCR引物序列、内参（GAPDH）。 阅读提示：Methods 2.19-2.20 |