H22细胞培养和小鼠腹水制备
扩增H22细胞并制备腹水，以获得足够数量的肿瘤细胞。
将H22细胞接种于KM小鼠腹腔，传代培养，收集腹水并分离H22细胞。
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基于H22荷瘤小鼠模型筛选肝细胞癌治疗潜在靶点的实验方案
Protocol for screening potential targets for the treatment of hepatocellular carcinoma based on H22 tumor-bearing mouse model.
实验完整度
中包含动物模型构建、药物处理、miRNA测序及RT-qPCR和Western blot验证，但缺乏双荧光素酶报告实验，且未包含体外功能实验（如CCK-8）验证。
主要模型
H22荷瘤小鼠模型 H22细胞 HepG2细胞
重点核对
小鼠品系：雄性3-5周龄ICR和KM小鼠，SPF级 H22细胞接种量：2×10^7细胞/只，皮下接种0.2 mL 药物剂量：ULP 300 mg/kg，5FU 20 mg/kg，灌胃或腹腔注射，每日一次，持续14天 RT-qPCR验证miR-542-3p表达，Western blot验证HNRNPU蛋白表达
摘要
调节癌症相关的微小RNA（miRNA）可能成为新一代的癌症治疗方式。在此，我们描述了一种基于肝癌22（H22）荷瘤小鼠筛选治疗肝细胞癌（HCC）潜在靶点的实验方案。我们详细介绍了H22荷瘤小鼠的构建以及两种天然化合物——石莼多糖（ULP）和5-氟尿嘧啶（5FU）的处理。我们进一步描述了肿瘤组织的分离以进行miRNA测序，以及发现和验证针对HCC的潜在miRNA基因靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何基于H22荷瘤小鼠模型筛选肝细胞癌治疗的潜在靶点？
- 核心机制
- ULP通过上调miR-542-3p表达，抑制靶基因HNRNPU的表达，从而发挥抗肿瘤作用。
- 主要证据
- 通过miRNA测序和RT-qPCR验证，ULP处理后miR-542-3p表达升高，HNRNPU mRNA和蛋白表达降低；过表达miR-542-3p可抑制HNRNPU表达。
- 研究意义
- 该方案可用于筛选其他天然化合物对肝癌的潜在治疗靶点，为肝癌治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建H22荷瘤小鼠模型及药物处理
建立H22皮下移植瘤模型，并给予ULP和5FU处理，观察抗肿瘤效果。
将H22细胞皮下接种至ICR小鼠，分组后给予ULP、5FU或联合处理，定期监测肿瘤生长。
基于miRNA测序分析ULP抗肿瘤机制
通过miRNA测序和靶基因预测，筛选ULP影响的差异miRNA及其潜在靶基因。
提取肿瘤组织RNA进行miRNA测序，分析差异miRNA，预测靶基因，并利用TCGA数据库验证表达。
验证miRNA对靶基因的调控
通过细胞转染和表达检测，验证miR-542-3p对候选靶基因HNRNPU的负调控作用。
在H22和HepG2细胞中转染miR-542-3p mimics或inhibitors，检测mRNA和蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640液体培养基 | Biosharp | BL303A |
| DMEM高糖液体培养基 | Biosharp | BL304A | |
| 优质胎牛血清 | Biosharp | BL201A | |
| 动物实验 | 5-氟尿嘧啶 | Aladdin | 51-21-8 |
| 石莼多糖 | Chao Zhao's Lab | -- | |
| RNA提取 | SanPrep柱式microRNA提取试剂盒 | Sangon | B518811 |
| RT-qPCR | miRNA第一链cDNA合成（加尾反应） | Sangon | B532451 |
| NovoScript Plus All-in-one第一链cDNA合成SuperMix（gDNA去除） | Novoprotein | E047 | |
| MicroRNAs qPCR试剂盒（SYBR Green法） | Sangon | B532461 | |
| NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus | Novoprotein | E096 | |
| Western blotting | Western和IP细胞裂解液 | Beyotime | P0013 |
| Western blot封闭液 | Beyotime | P0252 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L） | Beyotime | A0208 | |
| hnRNP U抗体 | Abmart | AF6626 | |
| α-微管蛋白兔多克隆抗体 | Beyotime | AF5012 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018AS | |
| PAGE凝胶快速制备试剂盒 | EpiZyme | PG112 | |
| 细胞转染 | GP-transfect-Mate转染试剂 | GenePharma | G04008 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| H22细胞培养和小鼠腹水制备 | 小鼠品系（KM）、周龄（3-5周）、H22细胞腹腔注射量（2.5×10^7细胞/只）、腹水培养时间（不超过8天） 阅读提示：Step-by-step method details, 'Cell culture and mouse ascites' |
| 构建H22荷瘤小鼠模型及药物处理 | 小鼠品系（ICR）、周龄（3-5周）、H22细胞皮下接种量（2×10^7细胞/只）、分组（Control、ULP、5FU、Combination）、给药剂量（ULP 300 mg/kg，5FU 20 mg/kg）、给药方式（灌胃、腹腔注射）、给药时间（每天一次，持续14天） 阅读提示：Step-by-step method details, 'Construction of H22 tumor-bearing mouse model and drug administration' |
| miRNA测序分析 | 测序公司（Novogene）、比较组（模型组 vs ULP组） 阅读提示：Step-by-step method details, 'Determination of anti-tumor effect of ULP based on miRNA sequencing' |
| RT-qPCR验证 | 引物序列（见表1）、反应体系（见表4）和循环条件（见表5） 阅读提示：Step-by-step method details, 'Total RNA and miRNA extraction' |
| Western blotting验证 | 一抗浓度（hnRNP U 1:1,000，α-Tubulin 1:1,000）、二抗浓度（未明确说明）、蛋白上样量（未明确说明） 阅读提示：Step-by-step method details, 'Western blotting' |