GFPBW1,一种来自灰树花的β-葡聚糖作为疫苗佐剂:APC的激活和成熟。

GFPBW1, a β-glucan from Grifola frondosa as vaccine adjuvant: APCs activation and maturation.

作者信息Xiang He, Jiang-Ling Lu, Wen-Feng Liao, Yi-Ru Long, Xing Zhang, Qian Zhu, Heng-Lei Lu, Geng-Yan Hao, Kan Ding, Jian-Hua Sun, Li-Kun Gong, Yi-Fu Yang
PMID38907048
发布时间2024-11
DOI10.1038/s41401-024-01330-8

实验完整度

包含体外APC活化、OVA免疫、安全评价、肿瘤预防和治疗模型及RNA-seq等多层级验证。

主要模型

小鼠脾细胞(C57BL/6) THP-1细胞 C57BL/6小鼠OVA免疫模型 B16-OVA荷瘤小鼠模型

重点核对

GFPBW1浓度(5、50、500 μg/mL)及作用时间(24或48 h) 免疫剂量(10、50、300 μg/只)及免疫方案(第0、14天) OVA抗原剂量(10 μg/只) 肿瘤细胞接种量(5×10^5 B16-OVA细胞) 铝佐剂联合使用剂量(50、300 μg/只)

摘要

目前缺乏通过利用抗原呈递细胞(APC)来改善适应性免疫的疫苗佐剂。在先前的工作中,我们从灰树花子实体中获得了一种新的可溶性300 kDa均一β-葡聚糖,命名为GFPBW1。GFPBW1可通过靶向树突状细胞相关C型凝集素1(Dectin-1)/Syk/NF-κB信号通路激活巨噬细胞,从而实现抗肿瘤作用。在本研究中,我们使用OVA抗原和B16-OVA肿瘤模型探讨了GFPBW1的佐剂效应。我们证明,GFPBW1(5、50、500 μg/mL)通过增加CD80、CD86和MHC II的表达,在体外剂量依赖性地促进APC的活化和成熟。我们以两周间隔用OVA联合GFPBW1(50或300 μg)对雌性小鼠进行两次免疫。GFPBW1显著且剂量依赖性地增加OVA特异性抗体滴度,包括IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3亚型,表明它可作为Th1和Th2型免疫反应的佐剂。此外,GFPBW1与铝佐剂联合使用能显著增加OVA特异性IgG2a和IgG2b的滴度,但对IgG1无显著影响,表明GFPBW1可作为铝佐剂的联合佐剂,以补偿Th1免疫的不足。对于用OVA加GFPBW1免疫的小鼠,主要器官或注射部位均未观察到明显的病理损伤,血液学参数也无异常。当GFPBW1作为B16-OVA癌症疫苗模型的佐剂时,预防性疫苗可实现完全的肿瘤抑制,治疗性疫苗可增强抗肿瘤疗效。差异表达基因富集在抗原加工过程,OVA加GFPBW1组中DC、B1细胞和浆细胞的肿瘤浸润增加,与其APC活化和成熟功能一致。总的来说,本研究系统描述了GFPBW1作为一种新型有效且安全的佐剂的特性,并强调了其在疫苗开发中的巨大潜力。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
GFPBW1是否能作为疫苗佐剂通过激活APC增强适应性免疫反应。
核心机制
GFPBW1激活APC(包括DC、巨噬细胞和B细胞),通过上调CD80/CD86/MHC II促进其成熟,进而增强Th1和Th2型免疫反应。
主要证据
体外实验显示GFPBW1增加APC表面标记和THP-1细胞TNF-α/IL-6分泌;体内OVA免疫模型显示抗体滴度增加;B16-OVA肿瘤模型中肿瘤生长抑制和生存期延长;RNA-seq显示抗原加工和免疫细胞浸润增强。
研究意义
GFPBW1作为新型安全有效的疫苗佐剂,可应用于预防性和治疗性肿瘤疫苗。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

GFPBW1体外激活APC

验证GFPBW1是否促进APC的活化与成熟。

从小鼠脾脏分离脾细胞,用GFPBW1(0、5、50、500 μg/mL)处理24或48小时,通过流式细胞术检测DC、巨噬细胞和B细胞的CD80、CD86和MHC II表达;THP-1细胞用PMA处理后,用GFPBW1处理24小时,ELISA检测TNF-α和IL-6分泌。

2

OVA免疫模型评估佐剂活性

评估GFPBW1对OVA抗原诱导的体液免疫反应的影响。

C57BL/6小鼠肌肉注射OVA(10 μg)联合GFPBW1(50或300 μg)两次,间隔两周,收集血清,ELISA检测OVA特异性IgG及亚型。

3

安全性评价

评估GFPBW1作为佐剂的体内安全性。

免疫C57BL/6和BALB/c小鼠,观察体重、体温、临床症状,进行血液学分析和主要器官及注射部位的H&E染色。

4

GFPBW1与铝佐剂联合效果

评价GFPBW1作为铝佐剂联合佐剂的能力,以补偿其Th1免疫缺陷。

C57BL/6小鼠分为5组,分别免疫saline、OVA、OVA+alum、OVA+alum+GFPBW1(50或300 μg),检测OVA特异性IgG和亚型。

5

预防性肿瘤疫苗模型

评估GFPBW1作为预防性疫苗佐剂对B16-OVA肿瘤的预防效果。

C57BL/6小鼠先免疫两次(间隔两周),6周后接种B16-OVA肿瘤细胞,监测肿瘤生长和生存;对无瘤小鼠进行再次接种挑战。

6

治疗性肿瘤疫苗模型

评估GFPBW1作为治疗性疫苗佐剂对已荷瘤小鼠的治疗效果。

C57BL/6小鼠皮下接种B16-OVA肿瘤细胞,在第6天和第13天免疫,监测肿瘤生长和生存。

7

肿瘤免疫微环境分析

探究GFPBW1作为佐剂对肿瘤组织基因表达和免疫细胞浸润的影响。

收集免疫后肿瘤组织进行RNA-seq,分析差异表达基因和免疫细胞浸润。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DEAE纤维素柱----
鲎试验试剂盒BioendoG010030
G因子抑制剂BioendoBT02
DMEM培养基MeilunbioMA0212
RPMI-1640培养基MeilunbioMA0215
青霉素/链霉素Invitrogen15140122
胎牛血清Life Technologies10100147
卵清蛋白Sigma-AldrichA5378
氢氧化铝凝胶InvivoGenvac-alu-250
红细胞裂解液Yeasen40401ES60
抗CD16/CD32抗体BD Biosciences553141
BV786仓鼠抗小鼠CD11c抗体BD Biosciences563735
PE/Cyanine7大鼠抗小鼠F4/80抗体eBioscience25-4801-82
PerCP-Cy™5.5大鼠抗小鼠CD45R/B220抗体BD Biosciences552771
PE仓鼠抗小鼠CD80抗体BD Biosciences553769
APC大鼠抗小鼠CD86抗体BD Biosciences560747
FITC大鼠抗小鼠I-A/I-E(MHCII)抗体BD Biosciences553623
ACEA NovoCyte流式细胞仪----
TNF-α ELISA试剂盒MultisciencesEK182-96
IL-6 ELISA试剂盒MultisciencesEK106/2-96
HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体Abcamab205719
HRP标记的山羊抗小鼠IgG1抗体Abcamab97240
HRP标记的山羊抗小鼠IgG2a抗体Abcamab97245
HRP标记的山羊抗小鼠IgG2b抗体Abcamab97250
HRP标记的山羊抗小鼠IgG3抗体Abcamab97260
Infinite F50酶标仪Tecan--
ADVIA 2120i血液分析仪----
TRIzol试剂Invitrogen15596026
Illumina链特异性mRNA文库制备试剂盒Illumina--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
APC活化实验
GFPBW1浓度(5、50、500 μg/mL)及处理时间(24或48 h);脾细胞密度(3×10^6 cells/mL)
阅读提示:详见Methods“Antigen presentation cell (APC) activation/maturation assay”
OVA免疫
小鼠品系(C57BL/6),免疫剂量(OVA 10 μg,GFPBW1 50或300 μg),免疫途径(肌肉注射),免疫方案(第0、14天),样本量(n=5)
阅读提示:详见Methods“Immunization of mice”
铝佐剂联合实验
铝佐剂剂量(10 μg/只),GFPBW1剂量(50或300 μg/只),物理混合方式
阅读提示:详见Methods“Immunization of mice”中的联合免疫部分
安全评价
小鼠品系(C57BL/6和BALB/c),剂量(OVA+GFPBW1 10、50、300 μg/只),高剂量多次免疫(1000 μg/只,第0、3、6、13天)
阅读提示:详见Methods“Safety evaluation”
预防性肿瘤模型
免疫提前量(6周),免疫方案(第0、14天),B16-OVA细胞接种量(5×10^5)及部位(右侧),肿瘤体积计算方法
阅读提示:详见Methods“Efficacy of tumor prevention”及图5图注
治疗性肿瘤模型
肿瘤接种后第6、13天免疫,B16-OVA接种量(5×10^5),免疫剂量(OVA 10 μg±GFPBW1 10、50、300 μg)
阅读提示:详见Methods“Tumor therapeutic efficacy”及图6图注
RNA-seq分析
样本量(每组4只),免疫时间(第6、13天),取样时间(第28天),差异表达和免疫浸润分析方法
阅读提示:详见Methods“RNA sequencing”及图7图注