GFPBW1体外激活APC
验证GFPBW1是否促进APC的活化与成熟。
从小鼠脾脏分离脾细胞,用GFPBW1(0、5、50、500 μg/mL)处理24或48小时,通过流式细胞术检测DC、巨噬细胞和B细胞的CD80、CD86和MHC II表达;THP-1细胞用PMA处理后,用GFPBW1处理24小时,ELISA检测TNF-α和IL-6分泌。
GFPBW1, a β-glucan from Grifola frondosa as vaccine adjuvant: APCs activation and maturation.
包含体外APC活化、OVA免疫、安全评价、肿瘤预防和治疗模型及RNA-seq等多层级验证。
小鼠脾细胞(C57BL/6) THP-1细胞 C57BL/6小鼠OVA免疫模型 B16-OVA荷瘤小鼠模型
GFPBW1浓度(5、50、500 μg/mL)及作用时间(24或48 h) 免疫剂量(10、50、300 μg/只)及免疫方案(第0、14天) OVA抗原剂量(10 μg/只) 肿瘤细胞接种量(5×10^5 B16-OVA细胞) 铝佐剂联合使用剂量(50、300 μg/只)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证GFPBW1是否促进APC的活化与成熟。
从小鼠脾脏分离脾细胞,用GFPBW1(0、5、50、500 μg/mL)处理24或48小时,通过流式细胞术检测DC、巨噬细胞和B细胞的CD80、CD86和MHC II表达;THP-1细胞用PMA处理后,用GFPBW1处理24小时,ELISA检测TNF-α和IL-6分泌。
评估GFPBW1对OVA抗原诱导的体液免疫反应的影响。
C57BL/6小鼠肌肉注射OVA(10 μg)联合GFPBW1(50或300 μg)两次,间隔两周,收集血清,ELISA检测OVA特异性IgG及亚型。
评估GFPBW1作为佐剂的体内安全性。
免疫C57BL/6和BALB/c小鼠,观察体重、体温、临床症状,进行血液学分析和主要器官及注射部位的H&E染色。
评价GFPBW1作为铝佐剂联合佐剂的能力,以补偿其Th1免疫缺陷。
C57BL/6小鼠分为5组,分别免疫saline、OVA、OVA+alum、OVA+alum+GFPBW1(50或300 μg),检测OVA特异性IgG和亚型。
评估GFPBW1作为预防性疫苗佐剂对B16-OVA肿瘤的预防效果。
C57BL/6小鼠先免疫两次(间隔两周),6周后接种B16-OVA肿瘤细胞,监测肿瘤生长和生存;对无瘤小鼠进行再次接种挑战。
评估GFPBW1作为治疗性疫苗佐剂对已荷瘤小鼠的治疗效果。
C57BL/6小鼠皮下接种B16-OVA肿瘤细胞,在第6天和第13天免疫,监测肿瘤生长和生存。
探究GFPBW1作为佐剂对肿瘤组织基因表达和免疫细胞浸润的影响。
收集免疫后肿瘤组织进行RNA-seq,分析差异表达基因和免疫细胞浸润。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 多糖制备 | DEAE纤维素柱 | -- | -- |
| 内毒素检测 | 鲎试验试剂盒 | Bioendo | G010030 |
| G因子抑制剂 | Bioendo | BT02 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Meilunbio | MA0212 |
| RPMI-1640培养基 | Meilunbio | MA0215 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140122 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 10100147 | |
| OVA免疫 | 卵清蛋白 | Sigma-Aldrich | A5378 |
| 氢氧化铝凝胶 | InvivoGen | vac-alu-250 | |
| 脾细胞制备 | 红细胞裂解液 | Yeasen | 40401ES60 |
| 流式分析 | 抗CD16/CD32抗体 | BD Biosciences | 553141 |
| BV786仓鼠抗小鼠CD11c抗体 | BD Biosciences | 563735 | |
| PE/Cyanine7大鼠抗小鼠F4/80抗体 | eBioscience | 25-4801-82 | |
| PerCP-Cy™5.5大鼠抗小鼠CD45R/B220抗体 | BD Biosciences | 552771 | |
| PE仓鼠抗小鼠CD80抗体 | BD Biosciences | 553769 | |
| APC大鼠抗小鼠CD86抗体 | BD Biosciences | 560747 | |
| FITC大鼠抗小鼠I-A/I-E(MHCII)抗体 | BD Biosciences | 553623 | |
| ACEA NovoCyte流式细胞仪 | -- | -- | |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | Multisciences | EK182-96 |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Multisciences | EK106/2-96 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体 | Abcam | ab205719 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG1抗体 | Abcam | ab97240 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG2a抗体 | Abcam | ab97245 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG2b抗体 | Abcam | ab97250 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG3抗体 | Abcam | ab97260 | |
| Infinite F50酶标仪 | Tecan | -- | |
| 安全评价 | ADVIA 2120i血液分析仪 | -- | -- |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| Illumina链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| APC活化实验 | GFPBW1浓度(5、50、500 μg/mL)及处理时间(24或48 h);脾细胞密度(3×10^6 cells/mL) 阅读提示:详见Methods“Antigen presentation cell (APC) activation/maturation assay” |
| OVA免疫 | 小鼠品系(C57BL/6),免疫剂量(OVA 10 μg,GFPBW1 50或300 μg),免疫途径(肌肉注射),免疫方案(第0、14天),样本量(n=5) 阅读提示:详见Methods“Immunization of mice” |
| 铝佐剂联合实验 | 铝佐剂剂量(10 μg/只),GFPBW1剂量(50或300 μg/只),物理混合方式 阅读提示:详见Methods“Immunization of mice”中的联合免疫部分 |
| 安全评价 | 小鼠品系(C57BL/6和BALB/c),剂量(OVA+GFPBW1 10、50、300 μg/只),高剂量多次免疫(1000 μg/只,第0、3、6、13天) 阅读提示:详见Methods“Safety evaluation” |
| 预防性肿瘤模型 | 免疫提前量(6周),免疫方案(第0、14天),B16-OVA细胞接种量(5×10^5)及部位(右侧),肿瘤体积计算方法 阅读提示:详见Methods“Efficacy of tumor prevention”及图5图注 |
| 治疗性肿瘤模型 | 肿瘤接种后第6、13天免疫,B16-OVA接种量(5×10^5),免疫剂量(OVA 10 μg±GFPBW1 10、50、300 μg) 阅读提示:详见Methods“Tumor therapeutic efficacy”及图6图注 |
| RNA-seq分析 | 样本量(每组4只),免疫时间(第6、13天),取样时间(第28天),差异表达和免疫浸润分析方法 阅读提示:详见Methods“RNA sequencing”及图7图注 |