SLJGP含药血清制备
获取用于体外实验的含药血清。
SD大鼠随机分为对照组和SLJGP组，SLJGP组灌胃0.92 g/kg SLJGP，对照组灌胃等体积生理盐水，每日两次，连续3天，末次给药2小时后采血制备血清。
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双龙接骨丸通过调节miR-217/RUNX2轴激活Wnt/β-catenin通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化
Shuanglongjiegu pill promoted bone marrow mesenchymal stem cell osteogenic differentiation by regulating the miR-217/RUNX2 axis to activate Wnt/β-catenin pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（增殖、成骨分化、茜素红染色）、双荧光素酶报告基因验证miR-217靶向RUNX2、miR-217 mimic/pcDNA-RUNX2功能回复实验及Wnt/β-catenin通路蛋白检测，多层级证据验证机制。
主要模型
大鼠BMSCs SD大鼠含药血清制备
重点核对
含药血清浓度：2.5%、5%、10% 成骨诱导时长：21天 miR-217 mimic和pcDNA-RUNX2转染 Wnt/β-catenin通路蛋白检测
摘要
本研究旨在探讨双龙接骨丸（SLJGP）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的影响，并基于miR-217/RUNX2轴探讨其机制。结果发现，SLJGP含药血清以剂量依赖性方式促进BMSCs的活力。在成骨分化条件下，SLJGP促进ALP、OPN、BMP2、RUNX2的表达以及BMSCs的成骨分化能力。此外，SLJGP显著降低miR-217的表达，且miR-217直接靶向RUNX2。经miR-217 mimic处理后，SLJGP对BMSCs增殖和成骨分化的促进作用显著受到抑制。miR-217 mimic与pcDNA-RUNX2共处理进一步证实miR-217/RUNX2轴参与SLJGP促进BMSCs成骨分化。此外，Wnt/β-catenin通路蛋白表达分析显示，SLJGP通过miR-217/RUNX2激活Wnt/β-catenin通路。总之，SLJGP通过调节miR-217/RUNX2轴并激活Wnt/β-catenin通路促进BMSCs成骨分化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SLJGP是否通过miR-217/RUNX2轴激活Wnt/β-catenin通路促进BMSCs成骨分化？
- 核心机制
- SLJGP下调miR-217，解除其对RUNX2的抑制，上调RUNX2表达，进而激活Wnt/β-catenin通路，促进BMSCs成骨分化。
- 主要证据
- ELISA显示SLJGP促进ALP、OPN、BMP2、RUNX2表达，茜素红染色显示钙结节增多；双荧光素酶报告基因证实miR-217靶向RUNX2；miR-217 mimic逆转SLJGP的促进作用，pcDNA-RUNX2回复该抑制；Western blot和免疫荧光显示Wnt1、β-catenin表达上调。
- 研究意义
- 研究阐明SLJGP治疗骨质疏松的可能机制，为临床应用提供理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
BMSCs分离与培养
获得用于实验的大鼠BMSCs。
从大鼠股骨和胫骨骨髓腔冲洗收集骨髓细胞，离心后用完全培养基培养，细胞融合80%时传代。
药物血清对BMSCs活力影响检测
筛选SLJGP最佳作用浓度。
BMSCs接种96孔板，分别用对照血清和不同浓度（2.5%、5%、10%）SLJGP血清处理48小时，CCK-8检测活力。
SLJGP对BMSCs成骨分化影响检测
验证SLJGP对BMSCs成骨分化的影响。
BMSCs分为普通培养基组、普通培养基+中浓度SLJGP组、成骨诱导组、成骨诱导+中浓度SLJGP组，成骨诱导21天，检测ALP、OPN、BMP2、RUNX2表达及茜素红染色。
miR-217靶向RUNX2验证
验证miR-217与RUNX2的结合关系。
靶基因预测并通过双荧光素酶报告基因实验验证，构建RUNX2-WT和RUNX2-Mut载体，转染细胞后检测荧光素酶活性。
miR-217/RUNX2轴功能验证
验证miR-217/RUNX2轴在SLJGP促进成骨分化中的作用。
在成骨诱导条件下，BMSCs分为对照组、SLJGP组、NC mimic+SLJGP组、miR-217 mimic+SLJGP组、miR-217 mimic+SLJGP+pcDNA-NC组、miR-217 mimic+SLJGP+pcDNA-RUNX2组，检测miR-217和RUNX2表达、细胞活力、成骨因子表达及钙化。
Wnt/β-catenin通路激活验证
验证SLJGP通过miR-217/RUNX2轴激活Wnt/β-catenin通路。
通过Western blot检测Wnt1、β-catenin、RUNX2蛋白表达，免疫荧光检测β-catenin表达及定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 双龙接骨丸 | -- | -- |
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素 | Biosharp | BL505A |
| 大鼠BMSCs完全培养基 | Procell | CM-R131 | |
| 成骨诱导 | 大鼠BMSCs成骨诱导分化培养基 | Procell | PD-008 |
| 细胞转染 | RiboFect CP转染试剂盒 | Ribobio | C10511-05 |
| Opti-MEM I培养基 | Gibco | 31985088 | |
| Lipo2000转染试剂 | Gibco | 11668500 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8工作液 | Biosharp | BS350B |
| 酶标仪 | BioTek | ELx800 | |
| ELISA检测 | 大鼠ALP ELISA试剂盒 | ZCIBIO | ZC-36805 |
| 大鼠OPN ELISA试剂盒 | ZCIBIO | ZC-36664 | |
| 大鼠BMP2 ELISA试剂盒 | ZCIBIO | ZC-36653 | |
| 大鼠RUNX2 ELISA试剂盒 | ZCIBIO | ZC-36954 | |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告系统 | Vazyme | DD1205-01 |
| 免疫荧光 | 破膜剂 | Biosharp | 0694 |
| 山羊血清封闭液 | Boster | AR1009 | |
| β-catenin一抗 | proteintech | 51067-2-AP | |
| FITC标记的山羊抗兔二抗 | Servicebio | GB22303 | |
| DAPI工作液 | ZSBIO | ZLI-9557 | |
| 图像采集 | OlyVIA数字扫描浏览软件 | OLYMPUS | -- |
| 图像分析 | Image-J分析系统 | -- | -- |
| Western blot | 细胞裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 蛋白酶抑制剂 | Biosharp | BL612A | |
| 磷酸酶抑制剂 | Biosharp | BL615A | |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime | P0009 | |
| Immobilon-PSQ PVDF膜 | Sigma-Aldrich | ISEQ00010 | |
| β-actin抗体 | abclonal | AC026 | |
| RUNX2抗体 | abclonal | A2851 | |
| Wnt1抗体 | Affinity | AF5315 | |
| β-Catenin抗体 | abclonal | A11932 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L)抗体 | Affinity | S0001 | |
| 超敏ECL Western HRP底物 | zen-bio | 17046 | |
| 荧光图像分析系统 | Tanon | 5200 | |
| RT-qPCR | Molpure细胞/组织总RNA提取试剂盒 | YEASEN | 19221ES50 |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | RR047A | |
| TB Green Premix Ex TaqII | Takara | RR820A | |
| QuantStudio实时荧光定量PCR系统 | ThermoFisher | -- | |
| Bulge-Loop miRNA qRT-PCR引物 | Ribobio | R10031.8 | |
| Bulge-Loop miRNA qRT-PCR起始试剂盒 | Ribobio | R11067.3 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物与含药血清制备 | SD大鼠周龄、体重、给药剂量、给药频次、给药时长、采血时间点 阅读提示：Methods: Animals |
| BMSCs分离与培养 | 细胞来源、培养基、培养条件（温度、CO2浓度）、传代融合度 阅读提示：Methods: Preparation of rat BMSCs |
| 成骨诱导分化 | 细胞接种密度、成骨诱导培养基、诱导时间、染色方法 阅读提示：Methods: Osteogenesis induction of BMSCs; Figure 1 |
| 细胞转染 | miRNA mimic浓度、质粒量、转染试剂用量、转染时间、培养基更换时间 阅读提示：Methods: Cell transfection |
| 活力检测 | 细胞密度、处理时间、CCK-8孵育时间、检测波长 阅读提示：Methods: Cell proliferative activity |
| 蛋白表达检测 | 抗体稀释度、封闭条件、孵育时间、曝光条件 阅读提示：Methods: Western blot analysis |