验证C. acnes诱导皮肤FGF21表达上调
探究C. acnes感染时皮肤中FGF21的表达变化及其定位。
向小鼠耳廓皮内注射活C. acnes，24小时后通过Western blot和免疫组化检测FGF21、FGFR1和KLB的表达和分布。
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皮肤中成纤维细胞生长因子21抑制痤疮丙酸杆菌介导的炎症反应
Suppression of Cutibacterium acnes-Mediated Inflammatory Reactions by Fibroblast Growth Factor 21 in Skin.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HaCaT、原代角质形成细胞和成纤维细胞共培养）和小鼠体内模型，通过Western blot、qPCR、免疫荧光、IHC等验证功能，并明确机制通路。
主要模型
HaCaT细胞 正常人原代表皮角质形成细胞（NHEK）和真皮成纤维细胞（NHDF）共培养模型 C57BL/6J小鼠耳部炎症模型
重点核对
C. acnes菌株（ATCC6919）及热灭活处理（80°C 30分钟） 细胞刺激浓度（1.0×10^7 CFU/mL）和FGF21浓度（20 ng/mL） 小鼠模型中C. acnes注射量（1.0×10^7 CFU/20μL）和FGF21浓度（50 μg/mL） 体内外实验中TLR2/NF-κB/MAPK通路蛋白磷酸化检测 FGFR1和KLB siRNA敲低实验
摘要
痤疮丙酸杆菌是一种常见的共生菌，与痤疮的发病机制密切相关。成纤维细胞生长因子21（FGF21）作为葡萄糖和脂质代谢及胰岛素敏感性的有利调节因子，近期被证明具有抗炎作用。然而，FGF21在痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应中的作用和机制尚未确定。本研究表明，真皮中的FGF21通过旁分泌方式抑制表皮中痤疮丙酸杆菌诱导的炎症，同时它通过由成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）和β-Klotho（KLB）组成的受体复合物在表皮层发挥作用。研究了FGF21对热灭活痤疮丙酸杆菌诱导的HaCaT细胞和注射活痤疮丙酸杆菌的小鼠耳朵的影响。在痤疮丙酸杆菌存在的情况下，FGF21在很大程度上抵消了痤疮丙酸杆菌诱导的Toll样受体2（TLR2）、下游核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活。FGF21还显著降低了促炎细胞因子的表达，包括白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子（TNF）-α。综上所述，这些发现表明FGF21抑制痤疮丙酸杆菌诱导的炎症，可能用于痤疮的临床管理和治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FGF21能否抑制痤疮丙酸杆菌诱导的皮肤炎症及其作用机制。
- 核心机制
- FGF21以旁分泌方式作用于表皮角质形成细胞，通过FGFR1/KLB受体复合物抑制TLR2/NF-κB/MAPK信号通路，从而减少促炎细胞因子的表达。
- 主要证据
- 体外HaCaT细胞和原代细胞共培养实验显示FGF21抑制TLR2/NF-κB/MAPK通路和炎症因子表达；小鼠耳部注射C. acnes模型验证了FGF21减轻炎症、降低浸润和细胞因子水平。
- 研究意义
- FGF21可能是痤疮临床治疗的新策略，为开发新的抗炎药物提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
阐明FGF21的旁分泌作用模式
确定FGF21是否由成纤维细胞分泌并作用于角质形成细胞。
分离NHEK和NHDF，分别用热灭活C. acnes刺激，检测FGF21、FGFR1和KLB表达；建立共培养体系，加入FGF21中和抗体验证作用。
体外验证FGF21的抗炎功能及受体依赖
在HaCaT细胞中验证FGF21对C. acnes诱导炎症的抑制作用及其依赖于FGFR1/KLB。
用FGF21处理C. acnes刺激的HaCaT细胞，检测炎症因子表达；敲低FGFR1或KLB后检测炎症因子变化。
体外机制研究：TLR2/NF-κB/MAPK通路
揭示FGF21抑制C. acnes诱导炎症的分子机制。
检测FGF21对C. acnes刺激的HaCaT细胞中TLR2表达、p65和IκBα磷酸化、NF-κB核转位、JNK和p38磷酸化的影响。
体内验证FGF21的抗炎作用
在活体小鼠模型中验证FGF21对C. acnes诱导的炎症的抑制作用。
小鼠耳廓皮内注射C. acnes和FGF21，24小时后观察耳部红肿、厚度、组织学变化和炎症因子表达。
体内机制验证：TLR2/NF-κB/MAPK通路
在体内验证FGF21抑制C. acnes诱导的TLR2/NF-κB/MAPK通路激活。
检测小鼠耳组织中TLR2表达、p65和IκBα磷酸化、p65核转位、JNK和p38磷酸化，以及TLR2和CD11b的荧光强度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 脑心浸液肉汤 | -- | -- |
| 细胞培养 | MEM培养基 | Procell | PM150410 |
| DMEM培养基 | Gibco | 11054020 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞处理 | 成纤维细胞生长因子21 | Wenzhou Medical University Gene Engineering Laboratory | -- |
| BAY11-7082 | MCE | -- | |
| SP600125 | Selleck | -- | |
| SB203580 | MCE | -- | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Beyotime Biotechnology | PF313 |
| 原代细胞分离 | 分散酶II | Sigma Aldrich | D4693-1G |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200072 | |
| 细胞培养 | 生长因子减少的基质胶 | Corning | 354234 |
| 无血清角质形成细胞培养基 | Sigma Aldrich | 133-500 | |
| 共培养 | Transwell小室 | Corning | 3413 |
| FGF21中和抗体 | R&D Systems | MAB25373 | |
| 对照山羊IgG | R&D Systems | AB108-C | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Abcam | -- | |
| Pierce NE-PER核和胞质提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 脱脂牛奶 | BD Biosciences | -- | |
| ECL底物 | Millipore | -- | |
| Amersham Image 600成像系统 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| SYBR Green PCR预混液 | Vazyme | -- | |
| RNA干扰 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| 组织学 | H&E染色试剂盒 | Solarbio | -- |
| 免疫组化 | DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 | Beyotime | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| FGF21抗体 | Abcam | AB171941 | |
| FGFR1抗体 | CST | 9740S | |
| β-Klotho抗体 | Abcam | AB33416 | |
| p65抗体 | Proteintech | 66535-1-IG | |
| 免疫组织化学 | MPO抗体 | Santa Cruz | SC-390109 |
| CD68抗体 | ABclonal | A13286 | |
| 免疫荧光 | TLR2抗体 | ABclonal | A19125 |
| CD11b抗体 | ABclonal | A1581 | |
| 显微镜 | Nikon ECLIPSE Ni显微镜 | Nikon | -- |
| 共聚焦显微镜 | Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌培养 | C. acnes菌株（ATCC6919），培养条件（37°C，厌氧，BHI培养基），灭活条件（80°C，30分钟） 阅读提示：Materials and Methods 4.1 |
| 细胞培养 | HaCaT细胞来源（Procell, CL-0090），培养基（MEM，10%FBS，1%P/S），刺激浓度（1.0×10^7 CFU/mL），FGF21浓度（20 ng/mL） 阅读提示：Materials and Methods 4.2 |
| 原代细胞分离和共培养 | NHEK/NHDF分离方法（dispase II，trypsin），共培养体系（Transwell），中和抗体浓度（4 μg/mL） 阅读提示：Materials and Methods 4.3, 4.4 |
| 动物模型 | 小鼠品系（C57BL/6J），周龄（6-8周），C. acnes注射剂量（1.0×10^7 CFU/20μL），FGF21浓度（50 μg/mL），处理时间（24小时） 阅读提示：Materials and Methods 4.5 |
| 蛋白检测 | 抗体列表，蛋白上样量（30 μg），核质分离试剂盒 阅读提示：Materials and Methods 4.6, 补充表S1 |
| mRNA检测 | 引物序列，内参GAPDH，SYBR Green试剂盒 阅读提示：Materials and Methods 4.7, 补充表S2 |
| RNA干扰 | siRNA序列（FGFR1/KLB），转染试剂（Lipofectamine 2000） 阅读提示：Materials and Methods 4.8 |
| 组织学分析 | 切片厚度（7 μm），H&E染色，IHC/IF染色条件（一抗稀释比例） 阅读提示：Materials and Methods 4.9 |