检测circCDR1表达及特征
评估circCDR1在ESCC组织和细胞中的表达水平,并验证其环状结构和稳定性。
通过RT-qPCR检测ESCC组织和细胞系中circCDR1表达;RNase R和放线菌素D处理评估其环状结构和稳定性;FISH和核质分离检测其亚细胞定位。
CircCDR1 sponges miR-1290 to regulate cell proliferation, migration, invasion, and apoptosis in esophageal squamous cell cancer.
研究包含患者组织样本、体外细胞功能实验、体内异种移植瘤模型及分子机制验证,具备独立证据层级。
ESCC组织及癌旁组织 人食管癌细胞系KYSE-30和TE-9 BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型
circCDR1的稳定性和闭环结构(RNase R处理) circCDR1与miR-1290的直接结合及负相关 过表达circCDR1或敲低circCDR1对细胞功能的影响 miR-1290 mimic对circCDR1效应的逆转作用 体内异种移植瘤模型中circCDR1对肿瘤生长和凋亡相关蛋白的影响
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估circCDR1在ESCC组织和细胞中的表达水平,并验证其环状结构和稳定性。
通过RT-qPCR检测ESCC组织和细胞系中circCDR1表达;RNase R和放线菌素D处理评估其环状结构和稳定性;FISH和核质分离检测其亚细胞定位。
验证circCDR1过表达对ESCC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。
将circCDR1过表达质粒转染KYSE-30和TE-9细胞,通过CCK-8、集落形成、划痕愈合、Transwell和流式细胞术检测细胞功能。
确定circCDR1是否直接结合miR-1290并影响其表达。
通过RNA pull-down、双荧光素酶报告基因和FISH验证circCDR1与miR-1290的结合;RT-qPCR检测circCDR1过表达或敲低后miR-1290的表达;Pearson相关分析组织中的相关性。
检查miR-1290 mimic是否能逆转circCDR1对细胞功能的影响。
在circCDR1过表达的细胞中共同转染miR-1290 mimic,再次检测上述细胞功能及凋亡/转移相关因子表达。
验证circCDR1和miR-1290在体内对肿瘤生长的影响。
将过表达circCDR1的KYSE-30和TE-9细胞注射到裸鼠皮下,待肿瘤体积达100mm3后分组注射circCDR1质粒和miR-1290 agomir,4周后检测肿瘤重量、体积和凋亡/增殖相关蛋白表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | C11875500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 16,140,071 | |
| RNA提取 | EasyPure miRNA提取试剂盒 | TransGen Biotech | ER601-01 |
| 氯仿 | Solarbio | YZ-1601383 | |
| 乙醇 | Aladdin | E111991 | |
| 无RNase水 | Real-Times | RF001 | |
| 胞质和核RNA纯化试剂盒 | AmyJet Scientific Incorporation | 37,400 | |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | 15,596 | |
| 异丙醇 | Macklin | H822173 | |
| RT-qPCR | EasyScript第一链cDNA合成SuperMix | TransGen Biotech | AE301-02 |
| PerfectStart Green qPCR SuperMix | TransGen Biotech | AQ601-01 | |
| RNase R处理 | RNase R试剂 | BioVision Incorporated | M1228 |
| 细胞转染 | Lipo2000转染试剂 | Promoter | P-lipo |
| CCK-8实验 | CCK-8试剂盒 | APExBIO | -- |
| RNA pull-down | C-1磁珠 | Life Technologies | C37488 |
| 生物素标记的circCDR1探针 | Life Technologies | 61,002 | |
| 双荧光素酶报告基因 | pmirGLO荧光素酶载体 | Promega | E1330 |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Abcam | ab228530 | |
| FISH | 荧光原位杂交试剂盒 | RIBOBIO | C10910 |
| Cy3标记的circCDR1探针 | -- | -- | |
| Dig标记的锁核酸miR-1290探针 | RIBOBIO | miRB0005880-2-1 | |
| 集落形成实验 | 甲醛 | Macklin | P804536 |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning Life Sciences | -- |
| 基质胶 | Corning Life Sciences | 354,248 | |
| 结晶紫 | Aladdin | C110704 | |
| 流式细胞术 | Annexin V/PI凋亡检测试剂盒 | Sangon Biotech | E606336 |
| 免疫组织化学 | 石蜡 | Yuanye | S25190 |
| 抗原修复液 | Beyotime | p0081 | |
| 内源性过氧化物酶封闭液 | Biodragon | BF06060 | |
| Ki-67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 二抗 | Thermo Scientific | G-21234 | |
| DAB显色试剂 | 4A Biotech | SFQ004 | |
| Western blot | NP-40裂解液 | Beyotime | P0013F |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0009 | |
| SDS-PAGE凝胶 | Beyotime | P0052A | |
| 硝酸纤维素膜 | Millipore | HTS112M | |
| 蛋白分子量标准 | Solarbio | PR1910 | |
| C caspase-3抗体 | Abcam | ab2302 | |
| Bcl-2抗体 | Abcam | ab59348 | |
| Bax抗体 | Abcam | ab32503 | |
| E-钙粘蛋白抗体 | Abcam | ab40772 | |
| N-钙粘蛋白抗体 | Abcam | ab18203 | |
| 波形蛋白抗体 | Abcam | ab92547 | |
| IGFBP3抗体 | Abcam | ab77635 | |
| LHX6抗体 | Abcam | ab22885 | |
| NFIX抗体 | Abcam | ab101341 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| 山羊抗兔IgG H&L二抗 | Abcam | ab205718 | |
| 显影液 | Beyotime | P0019 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织样本收集 | 60例ESCC患者癌组织和癌旁组织,收集时间、地点、伦理批准号 阅读提示:Methods: Tissue samples and ethics statement |
| 细胞培养 | 细胞系来源(Het-1A、EC9706、KYSE-220、TE-9、KYSE-150、KYSE-30)、培养基、FBS浓度、培养条件 阅读提示:Methods: Cell culture |
| RT-qPCR | 引物序列(表1)、内参基因(GAPDH、U6)、RT-qPCR试剂盒和系统 阅读提示:Methods: Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), Table 1 |
| circCDR1特征验证 | RNase R处理条件(40U,37℃30分钟)、放线菌素D浓度(2mg/ml)和处理时间(24h) 阅读提示:Methods: RNase R and actinomycin D treatments |
| 细胞转染 | 细胞密度(2.5×10^6)、质粒/siRNA/mimic用量(2μg)、Lipo2000用量(3μl)、转染时间(48h) 阅读提示:Methods: Cell transfection |
| 细胞功能实验 | CCK-8的细胞数(1×10^4)、集落形成细胞数(2×10^2)和培养时间(14天)、划痕愈合细胞数(3×10^5)和观察时间(0和48h)、Transwell细胞数(2×10^4或1.5×10^4)和培养时间(48h)、凋亡检测细胞数(2×10^5) 阅读提示:Methods: Cell counting kit-8 (CCK-8) assay, Colony formation assay, Wound healing assay, Transwell assay, Flow cytometry |
| RNA pull-down和双荧光素酶报告基因 | 探针序列、磁珠类型、报告载体构建、共转染细胞密度(3×10^4)和培养条件 阅读提示:Methods: Biotinylated RNA pull-down assay, Dual-luciferase reporter assay |
| 动物实验 | 小鼠品系(BALB/c裸鼠)、性别、年龄(6周)、体重(20-22g)、细胞注射数(2×10^6)、分组(NC+MC, circCDR1+MC, NC+M, circCDR1+M)、给药频率(每2天)、实验持续时间(4周)、麻醉剂剂量(50mg/kg) 阅读提示:Methods: Animals and subcutaneous xenograft |
| 组织学检测 | Ki-67抗体稀释度(1:500)、二抗稀释度(1:500)、DAB孵育时间(30分钟)、苏木精染色时间(10分钟) 阅读提示:Methods: Immunohistochemical assay |
| Western blot | 蛋白上样量(25μg)、抗体稀释度(如C caspase-3 1:2500, Bcl-2 1:2000等)、封闭条件(5%脱脂牛奶1.5小时) 阅读提示:Methods: Western blot assay |