环状RNA circCDR1海绵吸附miR-1290调控食管鳞状细胞癌的细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡

CircCDR1 sponges miR-1290 to regulate cell proliferation, migration, invasion, and apoptosis in esophageal squamous cell cancer.

作者信息Yong Fang, Jun Yin, Yaxing Shen, Hao Wang, Han Tang, Xiaosang Chen
PMID35289243
发布时间2022-06
DOI10.1080/15384101.2022.2050645

实验完整度

研究包含患者组织样本、体外细胞功能实验、体内异种移植瘤模型及分子机制验证,具备独立证据层级。

主要模型

ESCC组织及癌旁组织 人食管癌细胞系KYSE-30和TE-9 BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型

重点核对

circCDR1的稳定性和闭环结构(RNase R处理) circCDR1与miR-1290的直接结合及负相关 过表达circCDR1或敲低circCDR1对细胞功能的影响 miR-1290 mimic对circCDR1效应的逆转作用 体内异种移植瘤模型中circCDR1对肿瘤生长和凋亡相关蛋白的影响

摘要

由于circCDR1在食管鳞状细胞癌(ESCC)中异常表达,本研究探讨了circCDR1是否影响ESCC。具体来说,通过RT-qPCR检测circCDR1在ESCC中的表达及其线性异构体和稳定性。通过荧光原位杂交(FISH)检测circCDR1的定位。转染后,通过划痕愈合、CCK-8、集落形成和流式细胞术检测细胞生物学功能。通过生物信息学、FISH、RNA pull-down和双荧光素酶报告基因实验预测circCDR1的靶标。通过Pearson相关分析circCDR1与miR-1290的相关性。建立BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型,并通过免疫组织化学、western blot或RT-qPCR检测癌细胞和组织中circCDR1、miR-1290以及凋亡/转移/增殖相关因子的水平。结果表明,circCDR1在ESCC组织和细胞中低表达,而miR-1290高表达。circCDR1受到调控,并与miR-1290呈负相关。定位于细胞质的circCDR1抑制癌细胞的活力、增殖、迁移和侵袭,以及Bcl-2、N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达,但增强细胞凋亡以及C caspase-3、Bax、E-钙粘蛋白、IGFBP4、LHX6和NFIX的表达。在体内,circCDR1促进异种移植瘤重量和体积,以及C caspase-3和Bax的表达,但抑制肿瘤组织中Bcl-2、miR-1290和Ki-67的水平。circCDR1对癌细胞和组织的影响与miR-1290模拟物相反,并被其逆转。总之,circCDR1通过海绵吸附miR-1290在体外和体内调节ESCC的进展。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
circCDR1在食管鳞状细胞癌中的表达及其对癌细胞生物学功能的影响,以及其潜在作用机制。
核心机制
circCDR1通过海绵吸附miR-1290,解除miR-1290对下游靶基因(如IGFBP3、LHX6、NFIX)的抑制,从而抑制ESCC细胞的增殖、迁移、侵袭并诱导凋亡。
主要证据
体外实验显示circCDR1过表达抑制细胞活性、增殖、迁移、侵袭并促进凋亡;RNA pull-down和双荧光素酶报告基因实验证实circCDR1直接结合miR-1290;体内实验显示circCDR1过表达抑制肿瘤生长并促进凋亡相关蛋白表达。
研究意义
circCDR1可能作为食管鳞状细胞癌的潜在治疗靶点,为ESCC的治疗提供新的策略。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

检测circCDR1表达及特征

评估circCDR1在ESCC组织和细胞中的表达水平,并验证其环状结构和稳定性。

通过RT-qPCR检测ESCC组织和细胞系中circCDR1表达;RNase R和放线菌素D处理评估其环状结构和稳定性;FISH和核质分离检测其亚细胞定位。

2

评估circCDR1对细胞功能的影响

验证circCDR1过表达对ESCC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。

将circCDR1过表达质粒转染KYSE-30和TE-9细胞,通过CCK-8、集落形成、划痕愈合、Transwell和流式细胞术检测细胞功能。

3

验证circCDR1与miR-1290的相互作用

确定circCDR1是否直接结合miR-1290并影响其表达。

通过RNA pull-down、双荧光素酶报告基因和FISH验证circCDR1与miR-1290的结合;RT-qPCR检测circCDR1过表达或敲低后miR-1290的表达;Pearson相关分析组织中的相关性。

4

验证miR-1290对circCDR1效应的逆转作用

检查miR-1290 mimic是否能逆转circCDR1对细胞功能的影响。

在circCDR1过表达的细胞中共同转染miR-1290 mimic,再次检测上述细胞功能及凋亡/转移相关因子表达。

5

体内验证circCDR1和miR-1290的作用

验证circCDR1和miR-1290在体内对肿瘤生长的影响。

将过表达circCDR1的KYSE-30和TE-9细胞注射到裸鼠皮下,待肿瘤体积达100mm3后分组注射circCDR1质粒和miR-1290 agomir,4周后检测肿瘤重量、体积和凋亡/增殖相关蛋白表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
RPMI 1640培养基GibcoC11875500BT
胎牛血清Gibco16,140,071
EasyPure miRNA提取试剂盒TransGen BiotechER601-01
氯仿SolarbioYZ-1601383
乙醇AladdinE111991
无RNase水Real-TimesRF001
胞质和核RNA纯化试剂盒AmyJet Scientific Incorporation37,400
TRIzol试剂Invitrogen15,596
异丙醇MacklinH822173
EasyScript第一链cDNA合成SuperMixTransGen BiotechAE301-02
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601-01
RNase R试剂BioVision IncorporatedM1228
Lipo2000转染试剂PromoterP-lipo
CCK-8试剂盒APExBIO--
C-1磁珠Life TechnologiesC37488
生物素标记的circCDR1探针Life Technologies61,002
pmirGLO荧光素酶载体PromegaE1330
双荧光素酶报告基因检测试剂盒Abcamab228530
荧光原位杂交试剂盒RIBOBIOC10910
Cy3标记的circCDR1探针----
Dig标记的锁核酸miR-1290探针RIBOBIOmiRB0005880-2-1
甲醛MacklinP804536
结晶紫----
Transwell小室Corning Life Sciences--
基质胶Corning Life Sciences354,248
结晶紫AladdinC110704
Annexin V/PI凋亡检测试剂盒Sangon BiotechE606336
石蜡YuanyeS25190
抗原修复液Beyotimep0081
内源性过氧化物酶封闭液BiodragonBF06060
Ki-67抗体Abcamab15580
二抗Thermo ScientificG-21234
DAB显色试剂4A BiotechSFQ004
NP-40裂解液BeyotimeP0013F
BCA蛋白定量试剂盒BeyotimeP0009
SDS-PAGE凝胶BeyotimeP0052A
硝酸纤维素膜MilliporeHTS112M
蛋白分子量标准SolarbioPR1910
C caspase-3抗体Abcamab2302
Bcl-2抗体Abcamab59348
Bax抗体Abcamab32503
E-钙粘蛋白抗体Abcamab40772
N-钙粘蛋白抗体Abcamab18203
波形蛋白抗体Abcamab92547
IGFBP3抗体Abcamab77635
LHX6抗体Abcamab22885
NFIX抗体Abcamab101341
GAPDH抗体Abcamab8245
山羊抗兔IgG H&L二抗Abcamab205718
显影液BeyotimeP0019

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
组织样本收集
60例ESCC患者癌组织和癌旁组织,收集时间、地点、伦理批准号
阅读提示:Methods: Tissue samples and ethics statement
细胞培养
细胞系来源(Het-1A、EC9706、KYSE-220、TE-9、KYSE-150、KYSE-30)、培养基、FBS浓度、培养条件
阅读提示:Methods: Cell culture
RT-qPCR
引物序列(表1)、内参基因(GAPDH、U6)、RT-qPCR试剂盒和系统
阅读提示:Methods: Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), Table 1
circCDR1特征验证
RNase R处理条件(40U,37℃30分钟)、放线菌素D浓度(2mg/ml)和处理时间(24h)
阅读提示:Methods: RNase R and actinomycin D treatments
细胞转染
细胞密度(2.5×10^6)、质粒/siRNA/mimic用量(2μg)、Lipo2000用量(3μl)、转染时间(48h)
阅读提示:Methods: Cell transfection
细胞功能实验
CCK-8的细胞数(1×10^4)、集落形成细胞数(2×10^2)和培养时间(14天)、划痕愈合细胞数(3×10^5)和观察时间(0和48h)、Transwell细胞数(2×10^4或1.5×10^4)和培养时间(48h)、凋亡检测细胞数(2×10^5)
阅读提示:Methods: Cell counting kit-8 (CCK-8) assay, Colony formation assay, Wound healing assay, Transwell assay, Flow cytometry
RNA pull-down和双荧光素酶报告基因
探针序列、磁珠类型、报告载体构建、共转染细胞密度(3×10^4)和培养条件
阅读提示:Methods: Biotinylated RNA pull-down assay, Dual-luciferase reporter assay
动物实验
小鼠品系(BALB/c裸鼠)、性别、年龄(6周)、体重(20-22g)、细胞注射数(2×10^6)、分组(NC+MC, circCDR1+MC, NC+M, circCDR1+M)、给药频率(每2天)、实验持续时间(4周)、麻醉剂剂量(50mg/kg)
阅读提示:Methods: Animals and subcutaneous xenograft
组织学检测
Ki-67抗体稀释度(1:500)、二抗稀释度(1:500)、DAB孵育时间(30分钟)、苏木精染色时间(10分钟)
阅读提示:Methods: Immunohistochemical assay
Western blot
蛋白上样量(25μg)、抗体稀释度(如C caspase-3 1:2500, Bcl-2 1:2000等)、封闭条件(5%脱脂牛奶1.5小时)
阅读提示:Methods: Western blot assay