snoRNA表达谱筛选
鉴定TGF-β诱导EMT的乳腺癌细胞中差异表达的snoRNA。
对TGF-β处理和对照的MCF-7和MDA-MB-231细胞进行小RNA测序，分析差异表达snoRNA。
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小核仁RNA SNORA71A通过维持乳腺癌中ROCK2 mRNA稳定性促进上皮-间质转化
Small nucleolar RNA SNORA71A promotes epithelial-mesenchymal transition by maintaining ROCK2 mRNA stability in breast cancer.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、机制验证（RNA pull-down、RIP、放线菌素D实验）、体内异种移植和肺转移模型等多层级验证。
主要模型
MCF-7细胞系 MDA-MB-231细胞系 Balb/c裸鼠异种移植瘤模型 乳腺癌患者组织样本
重点核对
TGF-β1处理浓度20 ng·mL-1，处理时间48小时 SNORA71A过表达和沉默的效率验证（real-time PCR） ROCK2过表达和G3BP1沉默对SNORA71A功能的影响 放线菌素D浓度5 μg·mL-1，处理时间0-12小时 体内实验中细胞注射数量（6×10^6细胞/100 μL皮下，2×10^6细胞/200 mL尾静脉）
摘要
转移是癌症患者死亡的主要原因。小核仁非编码RNA（snoRNAs）是保守的60-300核苷酸的非编码RNA，参与mRNA和非编码RNA的转录后调控。尽管它们在癌症中发挥重要作用，但snoRNAs在上皮-间质转化（EMT）诱导的转移中的作用尚未被广泛研究。在此，我们使用小RNA测序筛选与EMT和乳腺癌转移相关的snoRNAs。我们发现SNORA71A在转移性乳腺癌组织中的表达高于非转移性样本。此外，SNORA71A促进了MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。机制上，SNORA71A升高了ROCK2（TGF-β信号负调控因子）的mRNA和蛋白水平。救援实验表明ROCK2消除了SNORA71A介导的增殖、迁移、侵袭和EMT增加。SNORA71A与mRNA稳定性调节蛋白G3BP1的结合增加了ROCK2 mRNA半衰期。此外，G3BP1缺失 abolished了SNORA71A介导的ROCK2上调。在体内，SNORA71A过表达促进了乳腺肿瘤生长，而SNORA71A敲低抑制了乳腺癌生长和转移。我们认为SNORA71A通过结合G3BP1并稳定ROCK2增强乳腺癌转移。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SNORA71A是否通过调控ROCK2 mRNA稳定性影响乳腺癌EMT和转移？
- 核心机制
- SNORA71A通过结合G3BP1，增强G3BP1与ROCK2 mRNA的结合，提高ROCK2 mRNA稳定性，进而促进TGF-β信号介导的EMT。
- 主要证据
- 体外细胞实验显示SNORA71A促进增殖、迁移、侵袭和EMT；RNA pull-down和质谱鉴定G3BP1为结合蛋白；RIP和放线菌素D实验证实G3BP1介导ROCK2 mRNA稳定性；体内小鼠模型证实SNORA71A促进肿瘤生长和转移。
- 研究意义
- SNORA71A可能作为乳腺癌诊断和转移预测的生物标志物，化学修饰的抗SNORA71A制剂可能成为抑制转移的新治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SNORA71A表达与临床相关性分析
验证SNORA71A在乳腺癌组织和细胞中的表达，并评估其与临床特征及预后的关系。
使用TCGA数据库和患者组织样本进行real-time PCR和ROC分析，评估SNORA71A表达与肿瘤分期、转移及预后的关系。
SNORA71A对细胞功能的影响
评估SNORA71A对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的影响。
在MCF-7和MDA-MB-231细胞中过表达或敲低SNORA71A，通过CCK-8、transwell、EdU、流式、免疫荧光和Western blot检测。
机制探究：SNORA71A调控ROCK2的分子机制
确定SNORA71A如何上调ROCK2的表达。
通过RNA pull-down和质谱鉴定SNORA71A结合蛋白，RIP验证G3BP1与ROCK2 mRNA结合，放线菌素D实验检测mRNA稳定性，FISH/IF共定位。
体内功能验证
验证SNORA71A对肿瘤生长和转移的影响。
使用稳定转染的MDA-MB-231细胞建立皮下异种移植和尾静脉肺转移模型，检测肿瘤生长和转移结节。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | 10-013-CVR |
| L15培养基 | BBI Life Sciences | E600016-0500 | |
| 胎牛血清 | GIBCO | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Sangon | -- | |
| TGF-β处理 | 转化生长因子-β1 | PeproTech | 100-21-10 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| snoRNA文库构建 | NEB小RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7560S |
| mRNA文库构建 | VAHTS总RNA-seq文库制备试剂盒 | Vazyme Biotech | #NR603 |
| 细胞增殖实验 | CCK-8试剂 | Dojindo | -- |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶/RNase染色缓冲液 | BD Biosciences | -- |
| 迁移实验 | 0.8微米24孔小室 | FALCON | 353097 |
| 侵袭实验 | BioCoat Matrigel 0.8微米24孔小室 | Corning | 354480 |
| 结晶紫 | Sigma | -- | |
| 增殖实验 | EdU检测试剂盒 | RiboBio | -- |
| 免疫荧光 | Hoechst 33342染料 | Sigma | -- |
| RNA pull-down | 磁珠RNA-蛋白Pull-Down试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| T7体外转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 链霉亲和素琼脂糖珠 | Invitrogen | -- | |
| RIP实验 | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| 抗G3BP1抗体 | Abcam | #ab181150 | |
| 实时荧光定量PCR | 逆转录试剂盒 | Thermo Bio | -- |
| 2× Master Mix试剂盒 | Roche | -- | |
| ABI Q6实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| E-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 波形蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| ROCK2抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| GAPDH抗体 | Absin Bioscience Inc. | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Beyotime | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Abcam | -- | |
| 增强化学发光试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI染料 | -- | -- |
| 荧光标记二抗 | Abcam | -- | |
| 测序 | Illumina HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- |
| 质谱分析 | Q-Exactive HF质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Agilent液相色谱仪 | Agilent | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EMT模型建立 | TGF-β1浓度20 ng·mL-1，处理时间48小时；细胞系MCF-7和MDA-MB-231；EMT标志物变化（E-cadherin降低，Vimentin升高） 阅读提示：Materials and methods 2.3 Cell culture and TGF-β treatment |
| 细胞转染 | 细胞密度3×10^5 cells/well（6孔板）；转染试剂Lipofectamine 2000；SNORA71A过表达载体pLVX-EGFP-IRES-Puro，ROCK2过表达载体pcDNA 3.1；siRNA序列见表S2 阅读提示：Materials and methods 2.4 Plasmid construction and cell transfection |
| 细胞增殖检测 | 细胞密度3×10^3 cells/well（96孔板）；CCK-8试剂10 μL；OD值测定时间24、48、72小时；波长450 nm 阅读提示：Materials and methods 2.10 Cell proliferation assay |
| 迁移和侵袭实验 | 小室孔径0.8 μm；细胞培养时间24小时；结晶紫染色30分钟；显微镜下随机3个视野计数；添加aphidicolin (1 mg/L) 排除增殖影响 阅读提示：Materials and methods 2.12 Cell migration and invasion assays |
| 机制验证 | RNA pull-down探针（SNORA71A反义链）制备；RIP实验使用抗G3BP1抗体 (#ab181150) 或IgG对照；放线菌素D浓度5 μg·mL-1；时间点0,3,6,9,12小时 阅读提示：Materials and methods 2.14-2.17 |
| 体内实验 | MDA-MB-231细胞稳定转染；皮下注射6×10^6细胞/100 μL PBS；尾静脉注射2×10^6细胞/200 μL PBS；样本量：过表达n=5，敲低n=6，肺转移n=5；肿瘤体积计算公式 width^2×length×0.5 阅读提示：Materials and methods 2.22 Xenograft assay |