LINC01559在胃癌中的表达分析
检测LINC01559在胃癌细胞系和正常胃上皮细胞中的表达水平。
通过RT-qPCR检测MKN45、HGC-27、SNU-1、AGS细胞和GES-1细胞中LINC01559的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ZEB1诱导的LINC01559通过招募IGF2BP2稳定ZEB1表达，加速胃癌细胞增殖、迁移和EMT过程
ZEB1-induced LINC01559 expedites cell proliferation, migration and EMT process in gastric cancer through recruiting IGF2BP2 to stabilize ZEB1 expression.
实验完整度
高包括细胞实验（增殖、凋亡、迁移、EMT）、体内移植瘤模型、ChIP、RNA pull-down、RIP、放线菌素D等机制验证，以及回补实验，多层级验证。
主要模型
胃癌细胞系 SNU-1 胃癌细胞系 AGS 正常胃上皮细胞系 GES-1 裸鼠移植瘤模型
重点核对
LINC01559在细胞中的敲低效率（sh/LINC01559#1/#2） 细胞增殖检测条件（EdU、集落形成） 凋亡检测条件（流式、JC-1） 迁移检测条件（transwell） 体内实验条件（细胞数量、注射方式、观察时间）
摘要
胃癌（GC）是一种常见的肿瘤类型，具有高转移率的特点。近年来，越来越多的研究表明lncRNA参与癌细胞增殖和迁移的调节。然而，长基因间非蛋白编码RNA 1559（LINC01559）在胃癌中的功能作用仍不清楚。在本研究中，我们应用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测发现LINC01559在胃癌细胞中表达显著增强。EdU、集落形成、JC-1和transwell等功能实验显示，沉默LINC01559可抑制胃癌细胞的增殖和迁移，同时促进细胞凋亡。此外，Western blot和免疫荧光实验检测了与上皮-间质转化（EMT）相关因子的表达，表明LINC01559敲低可阻断胃癌细胞中的EMT过程。此外，LINC01559沉默在体内抑制肿瘤生长。另外，染色质免疫沉淀（ChIP）实验证明，锌指E-box结合同源盒1（ZEB1）作为转录因子与LINC01559启动子结合并激活其在胃癌细胞中的表达。相应地，LINC01559招募胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IGF2BP2）稳定ZEB1 mRNA，从而上调胃癌细胞中的ZEB1。总之，本研究的结果可能为胃癌治疗提供一个新的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LINC01559在胃癌细胞中的表达及其对细胞增殖、迁移和EMT的影响，以及其调控机制。
- 核心机制
- ZEB1作为转录因子激活LINC01559转录，LINC01559通过招募IGF2BP2稳定ZEB1 mRNA，形成正反馈环路，促进胃癌进展。
- 主要证据
- RT-qPCR显示LINC01559在胃癌细胞中高表达；功能实验显示敲低LINC01559抑制增殖、迁移和EMT，促进凋亡；ChIP和荧光素酶报告实验证实ZEB1结合LINC01559启动子；RNA pull-down和RIP实验证实LINC01559与IGF2BP2结合，且IGF2BP2稳定ZEB1 mRNA；回补实验验证LINC01559通过ZEB1发挥作用。
- 研究意义
- 揭示LINC01559作为胃癌潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
敲低LINC01559对细胞增殖和凋亡的影响
评估LINC01559对胃癌细胞增殖和凋亡的调控作用。
在SNU-1和AGS细胞中敲低LINC01559，进行EdU、集落形成、流式细胞术和JC-1实验。
敲低LINC01559对迁移和EMT的影响
验证LINC01559对胃癌细胞迁移和EMT过程的作用。
transwell实验评估迁移能力，Western blot和免疫荧光检测EMT标志物。
体内肿瘤生长实验
评估敲低LINC01559对体内肿瘤生长的影响。
将sh/LINC01559#1或sh/Ctrl转染的细胞皮下注射到裸鼠，测量肿瘤体积和重量，并进行IHC分析。
ZEB1调控LINC01559转录的机制
确定ZEB1是否作为转录因子调控LINC01559表达。
过表达多种转录因子，RT-qPCR筛选影响LINC01559表达的因子；JASPAR预测结合位点；荧光素酶报告实验和ChIP验证结合。
LINC01559与IGF2BP2的相互作用
鉴定LINC01559的结合蛋白，并分析其在mRNA稳定性中的作用。
RNA pull-down结合质谱鉴定IGF2BP2，RIP验证结合，放线菌素D实验检测ZEB1 mRNA稳定性。
IGF2BP2对ZEB1 mRNA稳定性的调控
验证IGF2BP2是否稳定ZEB1 mRNA。
敲低IGF2BP2，检测ZEB1表达和mRNA稳定性。
回补实验验证LINC01559依赖ZEB1
验证LINC01559的功能是否通过ZEB1介导。
在敲低LINC01559的细胞中过表达ZEB1，检测增殖、凋亡、迁移和EMT相关蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Invitrogen | -- |
| F-12K培养基 | Invitrogen | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SYBR Green预混液 | Takara | -- | |
| EdU检测 | EdU Apollo-567试剂盒 | RIBOBIO | -- |
| 集落形成 | 结晶紫 | DINGGUO | -- |
| 流式凋亡 | PI/Annexin V细胞凋亡试剂盒 | Invitrogen | V13245 |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | 338960 | |
| JC-1检测 | JC-1染色工作液 | Beyotime | -- |
| transwell迁移 | Transwell小室 | BD Biosciences | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | |
| 抗E-cadherin抗体 | Proteintech | 60335-1-Ig | |
| 抗N-cadherin抗体 | Abcam | ab18203 | |
| 抗Slug抗体 | Cell Signaling Technology | 9585S | |
| 抗Twist抗体 | Abcam | ab187008 | |
| 抗ZEB1抗体 | Proteintech | 21544-1-AP | |
| 抗IGF2BP2抗体 | Cell Signaling Technology | 14672S | |
| 抗MAFK抗体 | Abcam | ab50322 | |
| 抗JUND抗体 | Cell Signaling Technology | 5000S | |
| 抗JUN抗体 | Proteintech | 66313-1-Ig | |
| 抗ESR1抗体 | Proteintech | 21244-1-AP | |
| 抗RFX5抗体 | Abcam | ab9255 | |
| 免疫荧光 | Cy3标记二抗 | -- | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 动物实验 | 裸鼠 | -- | -- |
| 免疫组织化学 | 抗Ki-67抗体 | Abcam | -- |
| 抗PCNA抗体 | Abcam | -- | |
| ChIP | ChIP检测试剂盒 | Millipore | -- |
| 荧光素酶报告 | pGL3载体 | -- | -- |
| 双荧光素酶报告检测系统 | Promega | -- | |
| FISH | FISH试剂盒 | RiboBio | -- |
| 亚细胞分离 | 细胞质和细胞核RNA纯化试剂盒 | Norgen Biotek | -- |
| RNA pull-down | Transcript Aid T7高产转录试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| MEGAclear试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 链霉亲和素磁珠 | Thermo | -- | |
| 考马斯亮蓝染色试剂盒 | Beyotime | -- | |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基类型、FBS浓度、培养条件 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture |
| 细胞转染 | 转染试剂、转染时间 阅读提示：Materials and Methods: Cell transfection |
| 敲低效率验证 | shRNA序列、转染效率、敲低验证方法 阅读提示：Results: Knockdown of LINC01559... |
| 增殖检测 | EdU实验和集落形成实验的具体条件 阅读提示：Materials and Methods: EdU assay, Colony formation assay |
| 凋亡检测 | 流式细胞术和JC-1实验的处理条件 阅读提示：Materials and Methods: Flow cytometry, JC-1 assay |
| 迁移检测 | Transwell实验的细胞数量、时间 阅读提示：Materials and Methods: Transwell assay |
| 体内实验 | 小鼠品系、细胞注射数量、观察时间、肿瘤测量方法 阅读提示：Materials and Methods: Tumor xenograft assay |
| 转录调控机制 | ZEB1过表达载体的构建、荧光素酶报告实验的启动子突变体、ChIP实验条件 阅读提示：Materials and Methods: Luciferase reporter assay, ChIP assay |
| RNA结合机制 | RNA pull-down和RIP实验条件 阅读提示：Materials and Methods: RNA pull-down assay, RIP assays |
| mRNA稳定性 | 放线菌素D处理的浓度和时间 阅读提示：Materials and Methods: Actinomycin D experiment |