临床样本与细胞系中miR-181d表达分析
验证miR-181d在顺铂耐药卵巢癌组织和细胞中的表达情况。
通过原位杂交检测78例卵巢癌患者组织中miR-181d表达，通过RT-qPCR检测A2780/DDP、COC1/DDP、SKOV3/DDP、OVCAR3/DDP及各自亲本细胞中miR-181d表达。
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致癌microRNA-181d结合OGT有助于卵巢癌细胞对顺铂的耐药性
Oncogenic microRNA-181d binding to OGT contributes to resistance of ovarian cancer cells to cisplatin.
实验完整度
高包含临床样本原位杂交、体外细胞功能实验（CCK-8、流式）、机制验证（双荧光素酶、Co-IP、泛素化）及体内异种移植瘤模型。
主要模型
A2780和A2780/DDP细胞系 COC1/DDP、SKOV3/DDP、OVCAR3/DDP细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 78例卵巢癌患者组织样本
重点核对
DDP处理浓度50 μmol/L，处理时间48小时 细胞转染试剂Lipofectamine 3000 体内DDP给药剂量3 mg/kg，每两天一次 每组6只裸鼠
摘要
卵巢癌（OC）是一种常见的妇科癌症，以高恶性潜能为特征。MicroRNA（miRNA或miR）与人类恶性肿瘤的化疗或放疗耐药性相关。在此，当前研究旨在探讨miR-181d参与OC细胞对顺铂（DDP）耐药的调控机制。首先，采用原位杂交方法检测DDP耐药或DDP敏感患者卵巢组织中miR-181d的表达。此外，通过RT-qPCR测定A2780细胞和A2780/DDP细胞系中miR-181d的表达。然后进行功能获得和功能丧失实验，以表征miR-181d对OC细胞行为的影响。我们探讨了miR-181d与OGT的亲和力，以及KEAP1的下游糖基化和NRF2的泛素化。此外，进行了体内实验以确定miR-181d在肿瘤对DDP耐药中的作用。miR-181d在DDP耐药患者的卵巢组织和A2780/DDP细胞系中高表达。miR-181d的异位表达增强了OC细胞对DDP的耐药性。此外，发现miR-181d靶向OGT mRNA的3'UTR，并负调控OGT表达。机制结果表明，OGT通过KEAP1的糖基化抑制NRF2表达，从而抑制OC细胞对DDP的耐药性。此外，miR-181d负向调控OGT/KEAP1/NRF2轴，在体内增强OC对DDP的耐药性。总体而言，这些发现表明，miR-181d介导的OGT抑制限制了KEAP1的糖基化，然后减少了NRF2的泛素化和降解，导致OC对DDP耐药。这项研究为OC的预防和控制提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miR-181d是否通过靶向OGT调控KEAP1/NRF2轴影响卵巢癌细胞对顺铂的耐药性？
- 核心机制
- miR-181d直接靶向OGT并抑制其表达，从而抑制KEAP1的糖基化，减少NRF2的泛素化和降解，导致NRF2表达增加，进而促进卵巢癌细胞对DDP的耐药性。
- 主要证据
- 临床样本原位杂交显示miR-181d在耐药组织中高表达；体外功能实验表明miR-181d增强细胞活力、抑制凋亡；双荧光素酶报告基因验证miR-181d与OGT 3'UTR结合；Co-IP和泛素化实验验证OGT/KEAP1/NRF2轴；体内异种移植瘤模型显示miR-181d促进肿瘤生长。
- 研究意义
- 该研究为理解卵巢癌化疗耐药机制提供了新见解，并提示miR-181d可作为预测卵巢癌患者化疗敏感性的新型生物标志物或治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
miR-181d功能获得与丧失实验
明确miR-181d对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响。
在A2780/DDP细胞中转染miR-181d inhibitor，在A2780细胞中转染miR-181d mimic，通过CCK-8、流式细胞术和Western blot检测细胞活力、凋亡和凋亡/增殖相关蛋白表达。
miR-181d靶基因验证
验证OGT是否为miR-181d的直接靶基因。
通过starBase、microRNA.org和TargetScan预测靶基因，与TCGA数据交叉，通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-181d与OGT 3'UTR结合，并通过Western blot和RT-qPCR检测OGT表达变化。
miR-181d通过OGT调控DDP耐药的功能验证
验证miR-181d是否通过下调OGT促进DDP耐药。
在A2780/DDP细胞中共转染miR-181d inhibitor和sh-OGT，或在A2780细胞中共转染miR-181d mimic和oe-OGT，检测细胞活力、凋亡及蛋白表达。
OGT调控KEAP1/NRF2轴的机制验证
阐明OGT通过糖基化KEAP1调控NRF2的分子机制。
通过Western blot检测OGT过表达或敲低后KEAP1和NRF2表达，通过Co-IP检测OGT与KEAP1相互作用、KEAP1糖基化及NRF2泛素化，并使用KEAP1 S104突变体验证。
miR-181d通过OGT/KEAP1/NRF2轴调控DDP耐药验证
在细胞水平验证miR-181d通过OGT/KEAP1/NRF2轴影响DDP耐药。
在A2780/DDP细胞中共转染miR-181d inhibitor和oe-NRF2，或在A2780细胞中共转染miR-181d mimic和sh-NRF2，检测细胞活力、凋亡及蛋白表达。
体内异种移植瘤实验
验证miR-181d/OGT/KEAP1/NRF2轴在体内对DDP耐药的影响。
将稳定转染miR-181d mimic和/或sh-NRF2的A2780细胞皮下接种于裸鼠，DDP腹腔注射，测量肿瘤体积并检测肿瘤组织中相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 原位杂交 | 蛋白酶K | Roche | -- |
| miR-181d探针 | Sigma | -- | |
| BM Purple显色底物 | Roche | 1 442 074 001 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Solarbio | -- |
| RPMI-1640培养基 | Hyclone | SH30809.01 | |
| 胎牛血清 | Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma | -- | |
| 顺铂 | Qilu Pharmaceutical Co., Ltd. | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000008 |
| miR-181d模拟物/抑制剂 | GenePharma | -- | |
| pGPU6载体 | GenePharma | C02001 | |
| pcDNA3.1载体 | Thermo Fisher Scientific | V79520 | |
| CCK-8实验 | CCK-8试剂盒 | Dojindo Laboratories | -- |
| 680酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC/PI试剂盒 | BD Biosciences Pharmingen | -- |
| Annexin V-FITC | Life Technologies | V13241 | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | pGL3-control载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| TD-20/20发光检测仪 | Promega | E5311 | |
| 免疫共沉淀 | Pierce免疫沉淀缓冲液 | Pierce | -- |
| 蛋白G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗KEAP1抗体 | Cell Signaling Technology | 4678 | |
| 抗NRF2抗体 | Abcam | ab137550 | |
| 正常IgG | Abcam | ab7099 | |
| 泛素化实验 | MG132 | MedChemExpress | HY-13259 |
| 糖基化检测 | 5SGlcNAc | -- | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 16096020 |
| 逆转录试剂盒 | Promega | M1701 | |
| miRNA第一链cDNA合成（加尾反应）试剂盒 | Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. | B532451 | |
| TaqMan microRNA检测 | -- | -- | |
| TaqMan通用PCR预混液 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Guangzhou Jiebeisi Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗OGT抗体 | Abcam | ab177941 | |
| 抗KEAP1抗体 | Abcam | ab196346 | |
| 抗NRF2抗体 | Abcam | ab137550 | |
| 抗泛素抗体 | Abcam | ab7780 | |
| 抗O-GlcNAc抗体 | Abcam | ab2739 | |
| 抗裂解caspase-3抗体 | Abcam | ab2302 | |
| 抗caspase-3抗体 | Abcam | ab13847 | |
| 抗PCNA抗体 | Abcam | ab32552 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab179467 | |
| 山羊抗兔IgG抗体 | Abcam | ab97051 | |
| 山羊抗小鼠IgG抗体 | Abcam | ab205719 | |
| Image Quant LAS 4000 C凝胶成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 78例卵巢癌患者的组织样本，化疗耐药组32例，化疗敏感组46例 阅读提示：Materials/subjects and methods 中的 Study subjects 部分 |
| 细胞培养与处理 | A2780/DDP等耐药细胞需用0.5 μg/mL DDP维持耐药性，实验前3天更换无DDP培养基；DDP处理浓度50 μmol/L，处理48小时 阅读提示：Materials/subjects and methods 中的 Cell culture, transfection, and grouping 部分 |
| 体外功能实验 | 转染试剂Lipofectamine 3000；细胞接种密度3×10^5/孔（6孔板），CCK-8实验接种1×10^3/孔（96孔板） 阅读提示：Materials/subjects and methods 中的 Cell culture, transfection, and grouping 和 CCK-8 assay 部分 |
| 机制验证实验 | MG132处理浓度10 μM，6小时；CHX处理25 μg/mL，1小时；5SGlcNAc处理50 μM，10小时 阅读提示：Materials/subjects and methods 中的 Ubiquitination assay 和 Glycosylation detection 部分 |
| 体内实验 | 每组6只裸鼠；细胞接种2×10^6个；DDP剂量3 mg/kg，每两天一次；肿瘤体积测量时间点5、10、15、20、25天 阅读提示：Materials/subjects and methods 中的 Xenograft tumor in nude mice 部分 |