细胞活力评估
评估伊维菌素对AR阳性和AR阴性前列腺癌细胞及正常前列腺细胞活力的影响
使用MTT法检测不同浓度伊维菌素处理24、48、72小时后细胞活力，计算IC50。
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整合分析揭示FOXA1和Ku70/Ku80为伊维菌素在前列腺癌中的靶点
Integrated analysis reveals FOXA1 and Ku70/Ku80 as targets of ivermectin in prostate cancer.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验（MTT、流式、Western blot）、RNA-seq、CETSA、TPP-TR、体内异种移植模型及机制验证（ChIP-qPCR、FAIRE-qPCR、DSB修复报告实验）。
主要模型
前列腺癌细胞系LNCaP、C4-2、22RV1 AR阴性前列腺癌细胞系DU145和PC-3 BPH患者原代基质细胞 22RV1异种移植小鼠模型
重点核对
伊维菌素处理浓度和时间（4、8、12 μM，48小时） 22RV1异种移植模型：小鼠品系BALB/c-nude，细胞接种量3×10^6，肿瘤体积约300 mm^3时去势，给药剂量10 mg/kg，每周三次 CETSA和ITDRF中伊维菌素浓度（50 μM）和处理时间（1小时） siRNA敲低FOXA1和Ku80的效率 RNA-seq分析中显著差异表达基因阈值（|log2(FoldChange)| > 1, padj < 0.05）
摘要
伊维菌素是一种广泛使用的抗寄生虫药物，并在多种癌症类型中显示出有前景的抗癌活性。尽管在肿瘤细胞中已鉴定出伊维菌素调节的多种信号通路，但很少有研究关注伊维菌素的确切靶点。在此，我们报道了伊维菌素在前列腺癌中的药理作用和靶点。伊维菌素导致G0/G1细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡和DNA损伤，并降低前列腺癌细胞中的雄激素受体（AR）信号。进一步的体内分析显示，伊维菌素可抑制22RV1异种移植肿瘤的进展。使用整合的组学分析，包括RNA-seq和热蛋白质组分析，叉头框蛋白A1（FOXA1）和非同源末端连接（NHEJ）修复执行器Ku70/Ku80被强烈提示为伊维菌素在前列腺癌中的直接靶点。伊维菌素与FOXA1的相互作用降低了AR信号和G0/G1细胞周期调节因子E2F1的染色质可及性，导致细胞增殖抑制。伊维菌素与Ku70/Ku80的相互作用损害了NHEJ修复能力。与AR信号抑制后同源重组修复能力下调协同，伊维菌素增加了细胞内DNA双链断裂并最终触发细胞死亡。我们的发现证明了伊维菌素在前列腺癌中的抗癌作用，表明其使用可能是前列腺癌的一种新的治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 伊维菌素在前列腺癌中的药理作用和直接靶点是什么？
- 核心机制
- 伊维菌素通过靶向FOXA1降低AR信号和E2F1的染色质可及性，从而抑制细胞增殖；通过靶向Ku70/Ku80阻断NHEJ修复，并协同AR信号抑制下调HR修复基因BRCA1和Rad51，导致DNA双链断裂积累和合成致死。
- 主要证据
- 体外细胞实验显示伊维菌素引起G0/G1阻滞、凋亡和DNA损伤；CETSA和TPP-TR证实伊维菌素与FOXA1和Ku70/Ku80的直接结合；体内22RV1异种移植模型显示肿瘤生长抑制。
- 研究意义
- 伊维菌素可作为前列腺癌的一种新的治疗策略，尤其是在CRPC和AR变异阳性情况下。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞周期和凋亡分析
检测伊维菌素对细胞周期和凋亡的影响
用流式细胞术分析PI染色的细胞周期分布，用Annexin V/PI双染检测细胞凋亡，Western blot检测凋亡标志物。
DNA损伤检测
评估伊维菌素是否诱导DNA损伤
通过碱性彗星实验检测DNA损伤，Western blot检测γH2A.X表达。
体内肿瘤模型验证
验证伊维菌素对体内肿瘤生长的影响
使用22RV1异种移植模型，小鼠去势后给予伊维菌素治疗，测量肿瘤体积并分析肿瘤组织中的Ki67、γH2A.X和PSA表达。
转录组分析
鉴定伊维菌素处理后的转录组变化
对C4-2和22RV1细胞进行RNA-seq，并进行GSEA和DEG分析。
靶点识别
鉴定伊维菌素的直接靶点
使用CETSA和TPP-TR分析伊维菌素与蛋白的相互作用。
机制验证
验证FOXA1和Ku70/Ku80在伊维菌素抑制前列腺癌中的作用
通过ChIP-qPCR和FAIRE-qPCR检测FOXA1结合和染色质可及性；通过siRNA敲低FOXA1或Ku80；通过报告载体实验检测NHEJ和HR修复效率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Corning | -- |
| DMEM培养基 | Lonza | -- | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | -- | |
| 活性炭剥离胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒-X | Invitrogen | -- | |
| 牛垂体提取物 | Gibco | -- | |
| 表皮生长因子 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 伊维菌素 | Sellleck | -- |
| 恩杂鲁胺 | Sellleck | -- | |
| MTT法 | MTT试剂 | Sigma | -- |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | BD Biosciences | -- |
| 细胞凋亡分析 | FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶体抑制剂混合物 | Sigma | -- | |
| 核质分离试剂盒 | G-Biosciences | -- | |
| PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9532 | |
| cleaved-caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| γH2A.X抗体 | Cell Signaling Technology | 2577 | |
| AR抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7305 | |
| PSA抗体 | Cell Signaling Technology | 5365 | |
| UBE2C抗体 | Cell Signaling Technology | 14234 | |
| E2F1抗体 | Cell Signaling Technology | 3742 | |
| FOXA1抗体 | Cell Signaling Technology | 53528 | |
| Ku70抗体 | Cell Signaling Technology | 4588 | |
| Ku80抗体 | Cell Signaling Technology | 2180 | |
| BRCA1抗体 | Cell Signaling Technology | 9009 | |
| Rad51抗体 | Cell Signaling Technology | 8875 | |
| Lamin B抗体 | Cell Signaling Technology | 13435 | |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47724 | |
| 彗星实验 | 彗星实验试剂盒 | Trevigen | -- |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | -- | -- |
| 衰老染色 | SA-β-半乳糖苷酶试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | Dako | M7240 |
| γH2A.X抗体 | Cell Signaling Technology | 80312 | |
| PSA抗体 | Cell Signaling Technology | 2475 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript反转录试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq II试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| ChIP-qPCR | Pierce琼脂糖ChIP试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FOXA1抗体 | Abcam | ab170933 | |
| AR抗体 | Abcam | ab108341 | |
| FAIRE-qPCR | RNase A | Invitrogen | -- |
| 蛋白酶K | -- | -- | |
| Zymo-I离心柱 | Zymo | -- | |
| siRNA转染 | siRNA | Ribobio | -- |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | -- | |
| TPP-TR | TMT10标记试剂 | -- | -- |
| Easy nLC系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q Exactive plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DSB修复实验 | I-SceI限制性内切酶 | NEB | -- |
| GeneJET PCR纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Turbofect转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件：LNCaP、VCaP、22RV1购自Procell，DU145购自ATCC，C4-2和LNCaP95由其他实验室提供；培养基（DMEM或RPMI1640）及添加剂（10% FBS或炭剥离FBS，1%青霉素/链霉素） 阅读提示：Methods: Cell Culture |
| 药物处理 | 伊维菌素和恩杂鲁胺的浓度及溶剂；处理时间（24、48、72小时） 阅读提示：Methods: MTT assay; Figure 1-3 |
| 细胞周期和凋亡分析 | PI染色和Annexin V/PI双染的流式分析；处理时间48小时；细胞系 阅读提示：Methods: Cell cycle analysis, Cell apoptosis analysis; Figure 2A-B |
| Western blot | 抗体稀释比例和货号；细胞裂解方法（RIPA缓冲液或核质分离试剂盒） 阅读提示：Methods: Western blot; Figure legends of Fig. 2C,E, 3A,C,E,F |
| DNA损伤彗星实验 | 碱性凝胶电泳条件；处理浓度和时间；阳性对照（多柔比星） 阅读提示：Methods: Comet assay; Figure 2D |
| 动物实验 | 小鼠品系、周龄、饲养条件；细胞接种量和Matrigel比例；去势时间；给药剂量和频率；样本量（n=5） 阅读提示：Methods: Xenograft tumor model; Figure 2F |
| RNA-seq和GSEA | 处理浓度（8或12 μM）和时间（48小时）；DEG筛选阈值；GEO登录号 阅读提示：Methods: RNA-seq and GSEA analysis; GEO: GSE169356 |
| CETSA和TPP-TR | 伊维菌素浓度（50 μM）和处理时间（1小时）；加热温度范围和时间；蛋白质定量方法 阅读提示：Methods: Cellular thermal shift assay (CETSA), TPP-TR |
| ChIP-qPCR和FAIRE-qPCR | 抗体：FOXA1 (Abcam #ab170933)和AR (Abcam #ab108341)；引物序列见补充表S1 阅读提示：Methods: ChIP-qPCR, FAIRE-qPCR; Figure 5D-E,L |
| siRNA转染 | siRNA序列和靶向基因（FOXA1或Ku80）；转染试剂Lipofectamine 2000；转染后处理时间 阅读提示：Methods: siRNA transfection; Figure 5F, Supplementary Fig. S8C |
| DSB修复报告实验 | 质粒来源（NHEJ/HR报告质粒及pDsRed-N1）；质粒线性化酶（I-SceI）；转染量；伊维菌素浓度（8 μM）和检测时间（48小时） 阅读提示：Methods: DNA damage repair assays; Figure 7D-E |