数据获取与差异基因筛选
从GEO数据库获取EWS转录组数据，筛选与正常组织相比差异表达的髓系特征基因。
从GSE17679数据集获取106个RNA-seq样本，提取82个MSGs，使用limma包以adj. p<0.05和|FC|≥1.5筛选出30个DE-MSGs，并展示热图和火山图。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
髓系特征基因用于预测尤文肉瘤预后和免疫景观的表征
Characterization of myeloid signature genes for predicting prognosis and immune landscape in Ewing sarcoma.
实验完整度
中研究包含生物信息学分析（差异表达、聚类、预后模型构建、功能富集），以及体外WB、qPCR和临床样本IHC验证，但缺乏动物模型或功能实验验证机制。
主要模型
GSE17679数据集（88例尤文肉瘤组织和18例正常组织） ICGC队列（57例尤文肉瘤组织） 尤文肉瘤细胞系RD-ES和A673 人间充质干细胞hMSC
重点核对
训练队列：GSE17679，含88例EWS和18例正常组织 预后模型基因：CTSD、SIRPA、FN1 验证队列：ICGC，含57例EWS组织 细胞系：RD-ES和A673（尤文肉瘤），hMSC（正常对照） IHC样本：六对石蜡包埋的EWS和癌旁组织
摘要
髓系细胞作为肿瘤微环境（TME）中高度异质性的亚群，与肿瘤发展密切相关。尤文肉瘤（EWS）的特征是肿瘤微环境中丰富的髓系细胞浸润。然而，髓系特征基因（MSGs）与EWS患者预后的相关性尚不清楚。在本研究中，我们在训练队列中综合表征了MSGs的表达，并将EWS患者分为两个亚型。免疫细胞浸润分析显示，MSGs亚型与不同的免疫状态密切相关。此外，通过单变量、LASSO和多变量Cox分析构建了一个三基因预后模型（CTSD、SIRPA和FN1），该模型在EWS患者中显示出极好的预后准确性。我们还开发了一个列线图，以更好地预测EWS的长期生存。功能富集分析显示，高风险组和低风险组的免疫相关通路显著不同。进一步分析显示，高风险组患者与免疫抑制微环境密切相关。最后，我们通过Western blot（WB）、qPCR和免疫组织化学（IHC）分析验证了这些候选基因的表达。总之，我们的研究确定MSGs模型与EWS患者的预后预测和免疫浸润密切相关，为EWS患者的临床治疗和管理提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 髓系特征基因（MSGs）在尤文肉瘤中的表达及其与患者预后和免疫浸润的相关性尚不清楚，本研究旨在探究其作为预后标志物的潜力。
- 核心机制
- 高风险组患者呈现免疫抑制微环境，M2巨噬细胞和中性粒细胞浸润增加，而CD8+ T细胞和NK细胞浸润减少，且免疫检查点和趋化因子受体表达上调，导致免疫逃逸和不良预后。
- 主要证据
- 通过GEO和ICGC队列的转录组数据构建并验证了CTSD、SIRPA和FN1三基因预后模型，KM曲线和ROC曲线显示其预后准确性；WB、qPCR和IHC验证了这三个基因在EWS中高表达，且IHC显示高风险组M2巨噬细胞和中性粒细胞浸润增加，CD8+ T细胞和NK细胞减少。
- 研究意义
- MSGs模型为EWS患者的预后预测和免疫治疗提供了新的策略，可能有助于开发新的治疗靶点并促进个体化治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
共识聚类分析确定亚型
根据DE-MSGs表达谱将EWS患者分为不同亚型，以评估其与免疫状态的关系。
使用ConsensusClusterPlus包进行共识聚类，通过CDF曲线确定最佳聚类数k=2，将患者分为两个亚型，并比较亚型间免疫细胞浸润差异。
构建和验证预后风险模型
构建基于MSGs的预后风险模型，并评估其在训练和验证队列中的预测准确性。
通过单变量Cox、LASSO和多变量Cox回归筛选出CTSD、SIRPA和FN1三个基因，构建风险评分公式，根据中位风险评分将患者分为高、低风险组，使用KM曲线和ROC曲线评估预后效果，并在ICGC队列中验证。
构建列线图预测模型
开发一个结合风险评分和临床特征的列线图，以预测EWS患者的长期生存概率。
基于训练队列，通过Cox回归整合临床特征和风险评分构建列线图，预测5年和7年生存率，并用C-index、ROC曲线和校准曲线评估其准确性。
功能富集分析与肿瘤微环境评估
探究高风险组和低风险组之间差异表达基因的功能，并评估两组样本的免疫细胞浸润和免疫抑制状态。
识别高、低风险组间的DEGs（adj. p<0.01, |FC|≥1.5），进行GO/KEGG富集分析和GSEA分析；使用ESTIMATE、CIBERSORT等算法评估TME评分和免疫细胞浸润，并比较免疫检查点和趋化因子受体表达。
体外验证候选基因表达
验证预后模型中三个基因（CTSD、SIRPA、FN1）在EWS细胞系和正常对照中的mRNA和蛋白表达差异。
培养EWS细胞系（RD-ES和A673）和正常对照hMSC，通过Western blot检测蛋白表达，通过qPCR检测mRNA表达。
临床样本验证
通过免疫组织化学验证候选基因在EWS组织和癌旁组织中的蛋白表达，并验证免疫细胞浸润模式的差异。
收集六对石蜡包埋的EWS和癌旁组织，进行IHC染色检测CTSD、SIRPA、FN1以及CD8、CD206、CD66b、CD57的表达，使用Image J计算阳性率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | -- | |
| CTSD抗体 | Proteintech | 21327-1-AP | |
| SIRPA抗体 | Affinity | AF0253 | |
| FN1抗体 | Proteintech | 15613-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| ECL发光液 | -- | -- | |
| qPCR | cDNA合成试剂盒 | Takara | -- |
| TB Green Premux Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | -- | |
| Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | CFX96 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 免疫组织化学 | DAB显色试剂盒 | CWBIO | CW2035S |
| CD8抗体 | Proteintech | 66868-1-lg | |
| CD206抗体 | Proteintech | 60143-1-lg | |
| CD66b抗体 | Abcam | ab300122 | |
| CD57抗体 | Servicebio | GB113461 | |
| Image J软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据获取与预后模型构建 | 训练队列GSE17679（88例EWS及18例正常样本）和验证队列ICGC（57例EWS样本） 阅读提示：见Materials and Methods 2.1 和 2.4 |
| 细胞培养 | 细胞系RD-ES和A673（EWS）及hMSC（正常对照）来源，培养条件（DMEM或RPMI1640，10% FBS，1% P/S，37°C，5% CO2） 阅读提示：见Materials and Methods 2.8 |
| Western blot和qPCR验证 | 抗体信息（CTSD、SIRPA、FN1、GAPDH）及qPCR引物序列（见Table 1） 阅读提示：见Materials and Methods 2.9 和 2.10，Table 1 |
| IHC验证 | 六对EWS和癌旁组织样本，抗体列表（CTSD、SIRPA、FN1、CD8、CD206、CD66b、CD57），DAB试剂盒 阅读提示：见Materials and Methods 2.11 |
| 数据分析 | R包版本、算法参数（如limma筛选阈值、共识聚类重复次数） 阅读提示：见Materials and Methods 2.2-2.7 |