SPOCK2 and SPRED1 function downstream of EZH2 to impede the malignant progression of lung adenocarcinoma in vitro and in vivo.
包含体外细胞实验（增殖、迁移、侵袭）、体内异种移植瘤模型、临床数据库分析及双荧光素酶报告基因等验证，涵盖功能与机制研究。
A549人肺癌细胞系 HCC827人肺癌细胞系 裸鼠异种移植瘤模型 TCGA LUAD数据库 Human Protein Atlas数据库
EZH2过表达对SPOCK2和SPRED1表达及转录活性的抑制作用 Tazemetostat处理对SPOCK2和SPRED1表达的影响 SPOCK2和SPRED1过表达对LUAD细胞增殖、迁移和侵袭的影响 裸鼠皮下移植瘤模型中SPOCK2和SPRED1对肿瘤生长的影响
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定受EZH2调控的下游基因，并确认其对SPOCK2和SPRED1的调控作用。
在A549细胞中过表达EZH2，检测EZH2和H3K27me3蛋白水平，并通过qRT-PCR检测多个候选下游基因（包括SPOCK2和SPRED1）的mRNA水平；进一步用Western blot验证EZH2对SPOCK2和SPRED1蛋白表达的影响；用EZH2抑制剂Tazemetostat处理细胞后检测SPOCK2和SPRED1的表达变化；通过双荧光素酶报告实验检测EZH2对SPOCK2和SPRED1启动子活性的影响。
评估SPOCK2和SPRED1在LUAD组织中的表达水平及其与患者生存的关系。
利用TCGA数据库分析SPOCK2和SPRED1在LUAD肿瘤组织与正常组织中的表达差异；通过Human Protein Atlas数据库进行生存分析。
检测SPOCK2和SPRED1过表达对LUAD细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。
在A549和HCC827细胞中分别转染SPOCK2或SPRED1过表达质粒并筛选稳定株，通过CCK-8实验和集落形成实验检测细胞增殖，通过划痕实验检测细胞迁移，通过Transwell实验检测细胞侵袭。
检验EZH2过表达是否能逆转SPOCK2或SPRED1对LUAD细胞恶性表型的抑制作用。
在A549细胞中共转染SPOCK2或SPRED1过表达质粒和EZH2过表达质粒或对照，通过CCK-8、划痕和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭的变化。
评估SPOCK2和SPRED1过表达对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。
将稳定过表达SPOCK2或SPRED1的A549细胞皮下注射至裸鼠右腋下，每4天测量肿瘤体积，28天后处死取瘤，通过qRT-PCR、Western blot和免疫组化检测SPOCK2、SPRED1和PCNA的表达。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Ham's F-12K培养基 | Procell | -- |
| RPMI-1640培养基 | Solarbio | -- | |
| 胎牛血清 | Tianhang | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| EZH2抑制剂处理 | Tazemetostat（EZH2抑制剂） | Shanghai yuanye Bio-Technology | -- |
| CCK-8实验 | CCK-8试剂 | Solarbio | -- |
| 划痕实验 | 光学显微镜（IX53） | Olympus | -- |
| Transwell侵袭实验 | 基质胶 | Corning Incorporated | -- |
| Transwell板 | LABSELECT | -- | |
| 集落形成实验 | Wright-Giemsa染色液 | KeyGEN | -- |
| 免疫组化 | PCNA一抗（1:100，A0264） | ABclonal | A0264 |
| HRP标记的山羊抗兔IgG（1:500） | Thermo Scientific | -- | |
| RNA提取 | TRIpure试剂 | BioTeke | -- |
| NANO 2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- | |
| RT-qPCR | BeyoRT II M-MLV逆转录酶 | BeyotimeBiotech | -- |
| SYBR Green I染料 | Solarbio | -- | |
| Exicycler 96 RT-PCR仪 | Bioneer | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 脱脂奶粉 | Sangon | -- | |
| HRP标记的抗IgG（1:10,000） | Solarbio | -- | |
| 增强化学发光试剂 | Solarbio | -- | |
| EZH2抗体（1:1000；5246） | CST | 5246 | |
| H3K27me3抗体（1:1000；35861） | CST | 35861 | |
| SPOCK2抗体（1:500；ab217044） | Abcam | ab217044 | |
| SPRED1抗体（1:500；ab77079） | Abcam | ab77079 | |
| GAPDH抗体（1:10000；ab8245） | Abcam | ab8245 | |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | KeyGEN | -- |
| 统计 | GraphPad Prism 7.0 | GraphPad Software | -- |
| 细胞系 | A549 | Procell | CL-0016 |
| HCC827 | iCell Bioscience Inc | iCell-h068 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源：A549 (Procell, CL-0016) 和 HCC827 (iCell-h068)；培养基：A549使用Ham's F-12K含10% FBS，HCC827使用RPMI-1640含10% FBS；培养条件：37°C，5% CO2。 阅读提示：Materials and methods, Cell culture |
| EZH2过表达和SPOCK2/SPRED1过表达 | 转染试剂：Lipofectamine 3000；转染后24小时收获细胞；稳定转染筛选：G418处理1-2周。 阅读提示：Materials and methods, Transfection of plasmids |
| EZH2抑制剂处理 | Tazemetostat浓度：0, 0.25, 0.5, 1, 2 μM；处理时间72小时。 阅读提示：Materials and methods, EZH2 inhibitor treatment |
| 体外功能实验 | CCK-8实验：每孔5×10^3细胞，检测时间点0, 24, 48, 72 h；划痕实验：丝裂霉素C 1 μg/mL处理1小时，观察0和24小时；Transwell实验：每孔3×10^4细胞，基质胶40 μL，孵育时间未明确说明。 阅读提示：Materials and methods, Cell counting Kit-8 (CCK-8) assay, Wound-healing assay, Transwell invasion assay |
| 体内异种移植瘤模型 | 动物品系：裸鼠，6-8周龄；注射细胞数：2×10^6；监测频率：每4天测量肿瘤体积；实验周期：28天。 阅读提示：Materials and methods, Xenograft study; Figure legends 5 |
