OGD/R细胞模型建立与Circ VRK1表达检测
建立OGD/R细胞模型，检测Circ VRK1在OGD/R处理下的表达变化。
HBMVECs在无糖DMEM中于1% O2、5% CO2、94% N2条件下培养2、4、8小时，再复氧24小时。通过CCK8和LDH检测细胞活力和毒性，通过circRNA微阵列和RT-qPCR检测Circ VRK1表达。
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Circ VRK1/microRNA-17/PTEN轴调节人脑微血管内皮细胞的血管生成以影响氧糖剥夺/复灌诱导的损伤
Circ VRK1/microRNA-17/PTEN axis modulates the angiogenesis of human brain microvascular endothelial cells to affect injury induced by oxygen-glucose deprivation/reperfusion.
实验完整度
高体外OGD/R细胞模型、功能缺失实验、体内小鼠缺血再灌注模型、双荧光素酶验证、拯救实验及通路蛋白检测
主要模型
HBMVECs C57BL/6小鼠脑缺血再灌注模型
重点核对
OGD/R处理时间：2 h、4 h、8 h，复氧24 h Circ VRK1 siRNA敲低效率：RT-qPCR验证 miR-17 inhibitor和PTEN siRNA的拯救作用 小鼠模型中Zea Longa评分和TTC染色评估脑梗死 PI3K/AKT通路磷酸化水平：PI3K和AKT磷酸化检测
摘要
背景：环状RNA（circRNAs）可作为microRNA（miRNA）海绵，从而调节基因表达。circRNAs在氧糖剥夺/复氧（OGD/R）过程中的作用尚不清楚。在此，我们探讨了Circ VRK1在OGD/R诱导的人脑微血管内皮细胞（HBMVECs）损伤中的作用机制。方法：在HBMVECs中建立OGD/R细胞模型。应用微阵列检测差异表达的circRNAs，随后进行亚细胞分离实验。集落形成实验、流式细胞术、ELISA、管形成、Transwell和western blot实验用于功能缺失实验。在已建立的小鼠模型中进行HE染色、TTC染色、免疫组化和western blot。通过生物信息学和双荧光素酶实验检测Circ VRK1与miR-17、miR-17与PTEN之间的关系。在体外和体内进行拯救实验，并通过Western Blot检测PI3K/AKT活性。结果：Circ VRK1主要存在于细胞质中，在暴露于OGD/R的HBMVECs中表达上调。Circ VRK1下调降低了HBMVECs的增殖、迁移、管形成、炎症因子和氧化应激，而增加了细胞凋亡。此外，Circ VRK1沉默降低了小鼠的神经损伤、脑梗死面积、CD34阳性细胞数和VEGF表达。Circ VRK1通过靶向miR-17介导PTEN表达和PI3K/AKT通路。miR-17缺失抑制了Circ VRK1 siRNA的作用，而PTEN沉默抑制了miR-17抑制剂的作用。结论：Circ VRK1在OGD/R期间表达上调。Circ VRK1下调通过靶向miR-17调节PTEN表达，从而促进PI3K/AKT通路活性以减轻OGD/R损伤。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Circ VRK1在OGD/R诱导的HBMVECs损伤和脑缺血再灌注损伤中的表达变化及其作用机制是什么？
- 核心机制
- Circ VRK1通过海绵吸附miR-17调控PTEN表达，进而影响PI3K/AKT通路活性。Circ VRK1下调可抑制miR-17，上调PTEN，并激活PI3K/AKT通路，从而减轻OGD/R损伤并促进血管生成。
- 主要证据
- 在HBMVECs和C57BL/6小鼠模型中，Circ VRK1 siRNA下调Circ VRK1，增加细胞增殖、迁移、管形成，减少凋亡和炎症；miR-17 inhibitor可逆转这些效应，而PTEN siRNA可逆转miR-17 inhibitor的效应；同时观察到PI3K和AKT磷酸化水平的变化。
- 研究意义
- 该研究揭示了Circ VRK1/miR-17/PTEN轴在脑缺血再灌注损伤中的重要作用，为脑缺血再灌注损伤的治疗提供了新的策略和潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Circ VRK1功能缺失实验（体外）
评估Circ VRK1敲低对OGD/R诱导的HBMVECs增殖、凋亡、迁移、管形成、炎症和氧化应激的影响。
通过慢病毒转染Circ VRK1 siRNA敲低Circ VRK1，随后进行集落形成、流式细胞术、ELISA、Transwell、管形成和Western blot检测相关指标。
Circ VRK1功能缺失实验（体内）
评估Circ VRK1敲低对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响。
建立C57BL/6小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，侧脑室注射Circ VRK1 siRNA慢病毒，通过Zea Longa评分、HE染色、TTC染色、IHC和Western blot评估神经损伤、脑梗死面积、CD34和VEGF表达。
机制验证：Circ VRK1/miR-17/PTEN轴
验证Circ VRK1与miR-17、miR-17与PTEN的靶向关系，以及其对PI3K/AKT通路的影响。
使用StarBase预测结合位点，双荧光素酶报告实验验证结合；在HBMVECs和脑组织中通过RT-qPCR和Western blot检测miR-17、PTEN、PI3K/AKT磷酸化水平；进行拯救实验（miR-17 inhibitor + PTEN siRNA）观察细胞功能变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 人脑微血管内皮细胞 | Angio-Proteomie | -- |
| 内皮细胞培养基 | ScienCell | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| OGD/R模型 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 细胞处理 | Circ VRK1小干扰RNA | 上海生工 | -- |
| miR-17抑制剂 | 上海生工 | -- | |
| PTEN沉默慢病毒载体 | 上海生工 | -- | |
| 细胞毒性检测 | CyQUANT™乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| circRNA微阵列 | 核糖核酸酶R | Epicentre Technologies | -- |
| Arraystar circRNA芯片 | Arraystar | -- | |
| Arraystar Super RNA标记试剂盒 | Arraystar | -- | |
| Agilent G2505C扫描仪 | Agilent Technologies | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 一步法RT-qPCR试剂盒 | Sangon Biotech | -- | |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 亚细胞分离 | PARIS试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| CCK8检测 | CCK8溶液 | Abmole Bioscience | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-APC/PI凋亡检测试剂盒 | Procell | -- |
| 炎症因子检测 | TNF-α ELISA试剂盒 | 北京索莱宝 | SEKH-0047 |
| IL-1β ELISA试剂盒 | 北京索莱宝 | SEKH-0002 | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | 北京索莱宝 | SEKH-0013 | |
| 氧化应激检测 | SOD检测试剂盒 | 北京索莱宝 | BC0170 |
| MDA检测试剂盒 | 北京索莱宝 | BC0020 | |
| ROS检测试剂盒 | 北京索莱宝 | CA1410 | |
| 迁移检测 | Transwell小室 | Corning | -- |
| Millipore滤膜 | Millipore | -- | |
| Nikon Eclipse Ti倒置显微镜 | Nikon | -- | |
| 管形成检测 | 基质胶 | Corning | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| VEGF抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7269 | |
| PI3K抗体 | Abcam | ab86714 | |
| p-PI3K抗体 | Abcam | ab182651 | |
| AKT抗体 | ProteinTech | 10176-2-AP | |
| p-AKT抗体 | ProteinTech | 66444-1-Ig | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L (HRP) | Abcam | ab205719 | |
| 山羊抗兔IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Novex™增强化学发光试剂 | Thermo Scientific | -- | |
| TTC染色 | TTC染色液 | Solarbio | -- |
| HE染色 | 苏木素染色液 | Solarbio | -- |
| 伊红 | Solarbio | -- | |
| IHC | CD34抗体 | Thermo Fisher | MA1-10202 |
| 二抗 | Abcam | ab205719 | |
| 双荧光素酶报告实验 | pmiR-RB-REPORT载体 | RiboBio | -- |
| 293T细胞 | ATCC | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Life Technologies | -- | |
| 双荧光素酶报告检测系统 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| OGD/R细胞模型 | OGD暴露时间：2 h、4 h、8 h；复氧时间：24 h 阅读提示：见Materials and methods：Cell culture and infection |
| Circ VRK1敲低 | 慢病毒MOI：10；感染时间：24 h 阅读提示：见Materials and methods：Cell culture and infection |
| 凋亡检测 | 凋亡检测试剂盒品牌：Procell；染色时间：5 min 阅读提示：见Materials and methods：Measurement of cell apoptosis |
| 炎症因子检测 | ELISA试剂盒货号：TNF-α SEKH-0047, IL-1β SEKH-0002, IL-6 SEKH-0013 阅读提示：见Materials and methods：Measurement of inflammatory and oxidative stress factors |
| 氧化应激检测 | SOD试剂盒货号：BC0170；MDA试剂盒货号：BC0020；ROS试剂盒货号：CA1410 阅读提示：见Materials and methods：Measurement of inflammatory and oxidative stress factors |
| 动物模型 | 小鼠品系：C57BL/6；体重：22.5±24 g；麻醉剂量：50 mg/kg戊巴比妥钠；线栓长度3.0 cm，直径0.104 mm；侧脑室注射慢病毒量：5 µL 阅读提示：见Materials and methods：Establishment of an animal model |
| 双荧光素酶报告实验 | 细胞：293T；转染试剂：Lipofectamine 3000；检测时间：转染后48 h 阅读提示：见Materials and methods：Luciferase reporter gene assay |