验证Sirt1与IFI16的相互作用
确定Sirt1是否与IFI16结合，并定位相互作用结构域。
在HEK293T细胞中共表达HA-IFI16与各Sirtuin家族成员，通过免疫共沉淀检测相互作用；在PMA-THP1细胞中验证内源相互作用；通过表达IFI16截短突变体定位结合域。
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Sirt1通过阻止干扰素诱导蛋白16在人类细胞中的胞质转位来负调控细胞抗病毒反应
Sirt1 Negatively Regulates Cellular Antiviral Responses by Preventing the Cytoplasmic Translocation of Interferon-Inducible Protein 16 in Human Cells.
实验完整度
高包含体外细胞模型（HaCaT、THP1、HEK293T等）和体内小鼠模型；涉及Sirt1过表达、敲低、敲除及药物激活/抑制等多层级功能验证，并验证IFI16依赖性机制。
主要模型
PMA-THP1细胞 HaCaT角质形成细胞 HEK293T细胞 小鼠模型（C57BL/6）
重点核对
Sirt1与IFI16的物理相互作用（免疫共沉淀） Sirt1对IFI16乙酰化水平的调控（乙酰化免疫沉淀） Sirt1对IFI16胞质转位的影响（免疫荧光和亚细胞分级） Sirt1对HSV-1或外源DNA诱导的IFN-β、IP-10、TNF-α等细胞因子产生的影响（qPCR和ELISA） Sirt1调控作用对IFI16的依赖性（IFI16敲低或敲除细胞）
摘要
干扰素诱导蛋白16（IFI16）在针对DNA病毒的抗病毒先天免疫反应中发挥关键作用。尽管IFI16的乙酰化对其胞质转位和下游信号转导至关重要，但IFI16乙酰化的调控机制仍不清楚。在本研究中，我们证明了NAD依赖性去乙酰化酶沉默信息调节因子1（Sirtuin1，Sirt1）与IFI16相互作用并降低IFI16的乙酰化，从而抑制IFI16的胞质定位以及针对DNA病毒和病毒DNA的抗病毒反应。同时，Sirt1不能抑制RNA病毒触发的信号转导。有趣的是，即使p204（人类IFI16的鼠直系同源物）也几乎不与Sirt1相互作用。因此，在小鼠细胞中，Sirt1不能负调控p204的乙酰化以及随后在单纯疱疹病毒1（HSV-1）感染时的信号转导。总之，我们的研究工作揭示了Sirt1调控IFI16介导的宿主防御的新机制。我们的研究还证明了人类和小鼠在抗病毒宿主防御调控中的差异，这在抗病毒治疗的临床前研究中可能值得考虑。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Sirt1是否以及如何调控IFI16介导的DNA病毒触发的先天免疫反应？
- 核心机制
- Sirt1与IFI16相互作用并去乙酰化IFI16，从而抑制IFI16的胞质转位及其与STING的相互作用，最终负调控IFN-β等抗病毒细胞因子的产生。
- 主要证据
- 免疫共沉淀显示Sirt1与IFI16结合；Sirt1过表达降低IFI16乙酰化，而敲低、敲除或抑制Sirt1则增加乙酰化；Sirt1抑制IFI16的胞质转位和IFI16-STING相互作用；Sirt1的作用在IFI16缺陷细胞中消失。
- 研究意义
- 本研究揭示了Sirt1作为IFI16介导抗病毒信号通路的新调控因子，并指出了人类和小鼠在抗病毒宿主防御调控上的差异，可能对临床前抗病毒治疗研究有参考意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测Sirt1对IFI16乙酰化的影响
验证Sirt1是否作为去乙酰化酶调节IFI16乙酰化水平。
在HaCaT细胞中过表达Sirt1或使用Sirt1抑制剂/激活剂，通过免疫沉淀检测IFI16乙酰化水平；在Sirt1敲低或敲除细胞中检测IFI16乙酰化。
评估Sirt1对DNA病毒触发先天免疫反应的影响
确定Sirt1表达水平或活性改变对HSV-1或外源DNA诱导的细胞因子产生和信号通路激活的影响。
在HaCaT或PMA-THP1细胞中过表达或敲低Sirt1，或用Sirt1抑制剂/激活剂处理，然后感染HSV-1或转染HSV60等，检测IFN-β、IP-10、TNF-α等mRNA和蛋白水平，以及TBK1、IRF3、p65的磷酸化；同时检测HSV-1病毒滴度。
验证Sirt1对IFI16胞质转位的影响
研究Sirt1是否通过影响IFI16的亚细胞定位来调控其功能。
使用免疫荧光和亚细胞分级实验，在HeLa、HaCaT或PMA-THP1细胞中观察Sirt1过表达、敲低或缺失对HSV-1或HSV60诱导的IFI16胞质转位的影响。
检测Sirt1对IFI16-STING相互作用的影响
验证Sirt1是否通过调节IFI16定位影响其与STING的结合。
通过免疫共沉淀和邻位连接技术（PLA）检测Sirt1敲低或缺失对IFI16-STING相互作用的影响。
评价Sirt1调控对IFI16的依赖性
确定Sirt1对DNA病毒免疫反应的调控是否依赖于IFI16。
在IFI16敲低（HaCaT）或敲除（THP1）细胞中，检测Sirt1抑制剂或激活剂对HSV-1诱导的免疫反应的影响。
体内及小鼠细胞验证Sirt1作用
探索Sirt1在体内以及小鼠细胞中对HSV-1感染的反应，并与人类细胞结果比较。
给小鼠注射Sirt1抑制剂Ex527后感染HSV-1，检测血清、肝脏和脾脏中细胞因子表达；在小鼠巨噬细胞系RAW264.7中检测Sirt1与p204的相互作用及p204乙酰化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | 未明确 | -- |
| RPMI 1640培养基 | 未明确 | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯 | Beyotime Biotechnology | S1819 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 药物处理 | Ex527 | Selleck | S1541 |
| SRT2104 | Selleck | S7792 | |
| 白藜芦醇 | Sigma-Aldrich | R5010 | |
| 刺激物 | HSV60 | InvivoGen | tlrl-hsv60n |
| poly(I:C) | InvivoGen | tlrl-picw | |
| poly(dA:dT) | InvivoGen | tlrl-patn | |
| VACV70 | Sangon Biotech | -- | |
| 免疫印迹 | 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 |
| 抗HA抗体 | Biolend | 901515 | |
| 抗Myc抗体 | Proteintech | 66004-1-Ig | |
| 抗IFI16抗体 | Santa Cruz | sc-8023 | |
| 抗Sirt1抗体 | Cell Signaling Technology | 2493 | |
| 抗磷酸化TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 5483T | |
| 抗TBK1抗体 | Flarbio | CSB-PA024154LA01HU | |
| 抗磷酸化IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4947 | |
| 抗IRF3抗体 | Proteintech | 11312-1-AP | |
| 抗磷酸化p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗p65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| 抗乙酰化赖氨酸抗体 | Cell Signaling Technology | 9441 | |
| 抗p204抗体 | Novus | NBP2-27153 | |
| 抗STING抗体 | Proteintech | 19851-1-AP | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 10068-1-AP | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Flarbio | CSB-PA010109LA01HU | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 60008-1 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| SYBR green qPCR预混液 | 未明确 | -- | |
| 实时荧光定量PCR | 7500 fast实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- |
| ELISA | IFN-β ELISA试剂盒 | Proteintech | KE00187 |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-7346-88 | |
| IFN-β ELISA试剂盒 | R&D | -- | |
| siRNA转染 | Silencer Select阴性对照siRNA | Invitrogen | 4390843 |
| 免疫荧光和PLA | Duolink PLA试剂盒 | Sigma | -- |
| 洗涤缓冲液 | Sigma | DUO82049 | |
| PLA探针 | Sigma | DUO92001, DUO92005 | |
| Duolink原位检测试剂（红色） | Sigma | DUO92008 | |
| 显微镜 | Nikon A1R显微镜 | Nikon | -- |
| 基因敲除 | CRISPR-Cas9系统 | -- | -- |
| 刺激物 | 环状GMP-AMP | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | PMA-THP1细胞需用100ng/mL PMA处理24h；HaCaT和HEK293T用DMEM培养，THP1用RPMI 1640培养；培养基添加10% FBS、4mM L-谷氨酰胺、100μg/mL青霉素、100U/mL链霉素。 阅读提示：见Materials and Methods中的Cell culture, transfection, and stimulation |
| 病毒刺激 | HSV-1（KOS株）以MOI=1感染细胞1.5h；HSV60、VACV70、poly(I:C)等刺激浓度分别为1μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL。 阅读提示：见Materials and Methods中的Viruses and infection以及各图注 |
| Sirt1活性调节 | Sirt1抑制剂Ex527使用浓度5μM；激活剂SRT2104使用浓度2-5μM，RSV使用100μM；NAM作为Sirtuin家族抑制剂使用浓度为5-10mM。 阅读提示：见Materials and Methods中的cDNA constructs and reagents以及相关图注 |
| 转染条件 | 使用Lipofectamine 2000进行细胞转染，按照制造商说明操作；siRNA转染浓度为未明确。 阅读提示：见Materials and Methods中的Cell culture, transfection, and stimulation和RNA interference |
| 体内实验 | C57BL/6小鼠腹腔注射Ex527（10mg/kg）或DMSO对照，注射48h后感染HSV-1（1×10^7 PFU）。 阅读提示：见图11A和图注 |
| 统计方法 | 数据以至少三次独立实验的均值±SD表示；采用非配对Student t检验，P<0.05认为有统计学意义。 阅读提示：见Materials and Methods中的Statistics |