建立条件重编程原代细胞系
从患者标本中建立保持肿瘤特征和异质性的原代宫颈癌细胞系。
从三例放射抗拒和两例放射敏感的宫颈癌患者获取肿瘤组织，通过胶原酶消化和条件重编程培养建立细胞系。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
利用单细胞转录组学洞察原发性宫颈癌放射抗拒的特征
Insights into the characteristics of primary radioresistant cervical cancer using single-cell transcriptomics.
实验完整度
高建立了原代细胞系，并通过免疫荧光、生长曲线、克隆形成、异种移植和免疫组化验证特征（体外和体内证据），进一步通过单细胞测序和流式验证细胞周期及机制。
主要模型
条件重编程（CR）原代宫颈癌细胞系（UCR4、UCR7、UCR8；UCS14、UCS19） BALB/c裸鼠异种移植模型 患者肿瘤标本（用于建立细胞系和验证）
重点核对
CR细胞系的建立方法（条件重编程，使用辐照的Swiss-3T3-J2饲养层细胞和完全F培养基） 放射抗拒与放射敏感的判定（基于患者的放疗反应史） 细胞周期分布（G1、S、G2/M）与放射敏感性的关联 USP7蛋白的表达水平（在放射抗拒细胞中降低）
摘要
放射抗拒是宫颈癌（CC）患者放疗失败的主要原因，宫颈癌是全世界女性癌症死亡原因的第四位。传统的宫颈癌细胞系失去了肿瘤内异质性，这对放射抗拒研究构成了挑战。同时，条件性重编程（CR）保留了肿瘤内异质性及复杂性，以及原始细胞和组织的基因组和临床特征。在CR条件下，从患者标本中建立了三株放射抗拒和两株放射敏感的原发性宫颈癌细胞系，并通过免疫荧光、生长动力学、克隆形成实验、异种移植和免疫组织化学验证了其特征。CR细胞系与原发肿瘤组织具有同质性特征，并在体外和体内保持放射敏感性，同时根据单细胞RNA测序分析保持了肿瘤内异质性。进一步研究发现，放射抗拒CR细胞系中20.83%的细胞聚集在G2/M细胞周期时相（对放射敏感），而放射敏感CR细胞系中为38.1%。本研究通过CR建立了三株放射抗拒和两株放射敏感的宫颈癌细胞系，这将有利于进一步研究宫颈癌的放射敏感性。我们目前的研究可能为研究宫颈癌放射抗拒的发展和潜在治疗靶点提供了一个理想的模型。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究旨在探讨宫颈癌放射抗拒的分子机制，并建立合适的体外模型。
- 核心机制
- 放射抗拒细胞主要阻滞在G1和S期，通过上调FoxO信号通路和氧化应激通路（例如ER应激、氧化磷酸化）来保护细胞免受照射损伤，且USP7表达降低。
- 主要证据
- 通过单细胞RNA测序分析放射抗拒（UCR4）和放射敏感（UCS19）细胞系，发现细胞周期分布差异（G1期比例高、G2/M期比例低），并通过流式验证了细胞周期分布，以及通过免疫组化和蛋白质印迹验证了USP7的表达。
- 研究意义
- 该研究为宫颈癌放射抗拒和潜在治疗靶点的研究提供了理想的模型，并提示USP7可作为放射增敏的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证细胞系特征
验证CR细胞系是否保留原发肿瘤的特征（如标志物表达、生长特性、遗传同源性）。
通过免疫荧光检测CK5、p63、Ki67和p16表达；通过生长曲线和克隆形成实验评估生长和放射敏感性；通过STR分析确认遗传同源性；通过异种移植和免疫组化评估体内致瘤性和标志物表达。
单细胞转录组分析
分析放射抗拒和放射敏感细胞系中的细胞异质性、细胞周期分布和分子特征。
使用10x Genomics Chromium平台对UCR4和UCS19进行scRNA-seq，通过t-SNE和UMAP聚类，分析细胞周期分布、CNV、差异基因和通路富集及伪时间轨迹。
验证细胞周期分布和相关蛋白表达
验证放射抗拒细胞在G1/S期积累以及相关蛋白（USP7、ERp29）的表达变化。
通过流式细胞术检测CR细胞系和传统细胞系的细胞周期分布；通过蛋白质印迹和免疫组化检测USP7和ERp29的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Biosharp | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Biosharp | -- | |
| 胰岛素 | Biosharp | -- | |
| 两性霉素B | Biosharp | -- | |
| 庆大霉素 | Biosharp | -- | |
| 霍乱毒素 | MedChem Express | -- | |
| 表皮生长因子 | Peprotech | -- | |
| 氢化可的松 | Biosharp | -- | |
| Y-27632（ROCK抑制剂） | AbMole Bioscience | -- | |
| IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞传代 | EDTA | Procell | -- |
| 胰蛋白酶/EDTA | Procell | -- | |
| 细胞培养 | 细胞筛网 | 文中未明确说明 | -- |
| 免疫荧光 | 腔室玻片 | Nest Scientific | -- |
| DAPI | Biosharp | -- | |
| 牛血清白蛋白 | 文中未明确说明 | -- | |
| Triton X-100 | 文中未明确说明 | -- | |
| 抗CK5抗体 | Abcam | -- | |
| 抗Ki67抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗p63抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗p16抗体 | ABclonal | -- | |
| 二抗 | Servicebio | -- | |
| STR分析 | 组织DNA提取试剂盒 | Omega | -- |
| 异种移植 | 免疫组化试剂盒 | Biossci | -- |
| 观察 | 相差显微镜 | Olympus | -- |
| 免疫荧光 | 荧光显微镜 | Olympus | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 7.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者标本收集 | 放射抗拒标本来自放疗后12个月内局部复发且未再照射或治疗的患者；放射敏感标本来自放疗后临床缓解且无病生存≥12个月的患者。 阅读提示：Materials and methods: Patient specimens |
| 原代细胞系建立 | 使用0.1% IV型胶原酶消化1小时，通过100 μm筛网过滤，离心条件（1000 rpm, 5 min, 4°C），使用辐照的Swiss-3T3-J2饲养层细胞和完全F培养基（成分及浓度见原文），培养于37°C、5% CO2。 阅读提示：Materials and methods: Establish primary cell lines by conditional reprogramming |
| 克隆形成实验 | 细胞铺板数量（文中未明确说明），照射剂量0-8 Gy，培养2-3周，克隆计数标准（>50个细胞）。 阅读提示：Materials and methods: Clonogenic assay; Figure 1e |
| 异种移植 | 动物品系（BALB/c裸鼠）、周龄（4-6周）、细胞注射量（5×10^6）、注射体积（100 μL DMEM）、注射部位（后肢左腹侧）。 阅读提示：Materials and methods: Xenograft models in nude mice |
| 单细胞RNA测序 | 使用的平台（10x Genomics Chromium），细胞数（UCR4 11808，UCS19 12208），分析工具（Cell Ranger等）及参数（见补充方法）。 阅读提示：Materials and methods: scRNA-seq analysis; Supplementary Methods |
| 细胞周期分析 | 流式细胞术检测细胞周期的具体方法（未详细描述），细胞系（UCR4, UCR7, UCR8, UCS14, UCS19）及传统细胞系ME180和C33A。 阅读提示：Results: 'Radioresistant CR cell lines mainly accumulate in the G1 and S phases of the cell cycle', Figure 4c |
| 蛋白质印迹 | 检测USP7和ERp29蛋白表达的具体实验条件（未详细描述）。 阅读提示：Results: Figure 5e |