源自硅酸钙提取物的硅酸盐离子延缓血管紧张素II诱导的心脏重构

Silicate Ions Derived from Calcium Silicate Extract Decelerate Ang II-Induced Cardiac Remodeling.

作者信息Xin Li, Yanxin Zhang, Qishu Jin, Qiaoyu Song, Chen Fan, Yiren Jiao, Chen Yang, Jiang Chang, Zhihong Dong, Yumei Que
PMID36920676
发布时间2023-08
DOI10.1007/s13770-023-00523-2

实验完整度

包含体外H9C2细胞模型和体内Ang II诱导小鼠模型、超声心动图、组织学、分子表达等多项验证,及功能验证(基因表达、细胞内钙、心功能)和机制探讨(钙信号、血管生成)。

主要模型

H9C2大鼠心肌细胞系 Ang II诱导的心脏肥厚小鼠模型(C57/BL6J小鼠)

重点核对

硅酸钙提取物浓度:体外实验使用1/16稀释度,体内使用硅酸盐离子浓度77.6 μg/mL Ang II处理条件:体外1 μM处理48小时;体内1000 ng/kg/min持续泵入28天 动物实验分组:Saline对照、Ang II+Saline、Ang II+CS,静脉注射7次,隔天一次 心功能指标:LVEF、LVFS、LVPW;s等通过Vevo 3100测量

摘要

背景:病理性心脏肥厚是心力衰竭的主要激活因素之一。目前,尚无药物能完全逆转或抑制病理性心脏肥厚的发展。为此,我们提出了一种基于硅酸钙(CS)生物陶瓷提取物的硅酸盐离子疗法,用于治疗血管紧张素II(Ang II)诱导的心脏肥厚。方法:在本研究中,建立了Ang II诱导的心脏肥厚小鼠模型,并对小鼠静脉注射硅酸盐离子提取物。使用高分辨率Vevo 3100小动物超声成像系统评估心脏功能。分别使用麦胚凝集素、Fluo4-AM染色和免疫荧光染色评估心脏肥厚、细胞内钙和心脏组织的血管生成。结果:体外结果显示,硅酸盐离子能抑制心肌细胞的细胞大小,降低心脏肥厚相关基因的表达,包括心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)和β-肌球蛋白重链(β-MHC),并降低Ang II诱导的细胞内钙含量。体内实验证实,静脉注射硅酸盐离子能显著抑制心脏肥厚并促进毛细血管形成,进一步缓解Ang II诱导的心脏功能紊乱。结论:本研究表明,CS释放的硅酸盐离子具有作为病理性心脏肥厚新治疗策略的潜在价值,为临床试验提供了新的见解。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
硅酸钙提取物释放的硅酸盐离子能否抑制血管紧张素II诱导的心脏肥厚,并改善心脏功能?
核心机制
硅酸盐离子通过降低心脏肥厚相关基因(ANP、BNP、β-MHC)的表达,调节细胞内钙稳态,并促进血管生成(上调VEGF、bFGF、KDR),从而缓解心脏肥厚和改善心脏功能。
主要证据
体外实验显示硅酸盐离子减小H9C2细胞面积,降低肥厚基因表达,并逆转Ang II诱导的细胞内钙升高;体内实验显示硅酸盐离子降低心脏重量/体重比、心肌细胞横截面积、心脏肥厚基因表达,增加毛细血管密度,改善LVEF、LVFS等心功能参数。
研究意义
硅酸盐离子疗法可能成为治疗病理性心脏肥厚等慢性心脏重构疾病的新治疗策略,为临床试验提供了新见解。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

体外细胞模型建立与处理

建立Ang II诱导的H9C2心肌细胞肥厚模型,并评估硅酸盐离子(CS提取物)对心肌细胞肥厚的影响。

H9C2细胞以指定密度接种,用1 μM Ang II处理48小时,同时加入或不加入CS提取物(1/16稀释);检测细胞大小、肥厚基因表达和细胞内钙水平。

2

体内动物模型建立与干预

建立Ang II诱导的心脏肥厚小鼠模型,并评估静脉注射硅酸盐离子对心脏肥厚和心脏功能的影响。

8周龄雄性C57/BL6J小鼠皮下植入含Ang II的Alzet渗透压泵(1000 ng/kg/min),持续28天;在14天内隔天静脉注射100 μL含硅酸盐离子的生理盐水或生理盐水对照共7次;通过超声心动图、血压测量、组织学分析、qPCR等评估效果。

3

心脏功能与血压评估

评估硅酸盐离子对Ang II诱导心脏肥厚小鼠心脏功能和血压的影响。

使用Vevo 3100小动物超声成像系统记录M型超声心动图,测量LVEF、LVFS、LVAW、LVPW等参数;使用无创血压监测仪(BP-2010A)测量血压和心率。

4

组织学与分子分析

评估硅酸盐离子对心肌肥厚和血管生成的组织学及分子水平影响。

心脏组织固定、包埋、切片,进行H&E染色、WGA染色(评估心肌细胞大小)、CD31免疫荧光染色(评估毛细血管密度);通过qRT-PCR检测肥厚相关基因(ANP、BNP、β-MHC)和血管生成相关基因(VEGF、bFGF、KDR)的表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
硅酸钙(CS)粉末Kunshan Chinese Technology New Materials Co., Ltd--
达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)----
0.22 μm过滤器Millipore--
胎牛血清----
青霉素----
链霉素----
山羊血清----
吐温20----
心肌肌钙蛋白I(cTnI)抗体Proteintech15513-1-AP
Cy3标记的亲和纯化山羊抗兔IgG (H+L)ProteintechSA00009-2
DAPISolarbioC0065
尼康A1共聚焦显微镜Nikon--
RNA提取试剂盒YEASENM3211070
超微量分光光度计DeNovixDS-11
Hifair®III第一链cDNA合成预混液(qPCR)YEASENH6201080
Hieff® qPCR SYBR® Green预混液(无Rox)YEASENH7101190
Fluo-4AMSolarbioF8500
Hank's平衡盐溶液ServicebioG4203
Hank's平衡盐溶液ServicebioG4210
HEPES缓冲液----
Alzet渗透压泵DURECT CorporationModel 2004
Vevo 3100小动物超声成像系统VisualSonics--
无创血压监测仪SoftronBP-2010A
麦胚凝集素(WGA)Shanghai source leafS25064
抗CD31抗体ServicebioGB11063-2
荧光显微镜Carl ZeissAxio Vert.A1
GraphPad Prism 7----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
CS提取物制备
CS粉末与无血清DMEM或生理盐水的料液比(1:5 g/mL)、振荡条件(120 rpm/min,37°C,24h)、离心条件(4000 rpm/min,5min)、过滤(0.22μm)、稀释比例(体外1/16)
阅读提示:Methods部分 'Preparation of CS extract'
体外细胞实验
H9C2细胞密度(2×10^3或3×10^4细胞/孔)、Ang II浓度(1μM)、处理时间(48h)、CS提取物稀释比例(1/16)
阅读提示:Methods部分 'Cell Culture'、'Immunofluorescent staining of cTnI'、'Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis'
动物模型建立与干预
小鼠品系(C57/BL6J)、年龄(8周龄)、性别(雄性)、Ang II剂量(1000 ng/kg/min)、泵入时间(28天)、CS给药方式(静脉注射100μL,7次,隔天一次)、分组(Saline、Ang II+Saline、Ang II+CS)
阅读提示:Methods部分 'Animal and treatment'
心脏功能评估
超声系统(Vevo 3100)、探头频率(30-MHz)、麻醉方式(异氟醚)、测量参数(LVEF、LVFS、LVAW、LVPW等)、连续心动周期数(3个)
阅读提示:Methods部分 'Echocardiographic measurements'
血压测量
测量时间点(7、14、28天)、设备(BP-2010A)、指标(收缩压、舒张压、平均压、心率)
阅读提示:Methods部分 'Blood Pressure (BP) measurements'
组织学与分子分析
组织固定(4%PFA)、切片厚度(5μm)、WGA浓度(10μg/mL)、CD31抗体(GB11063-2)、qPCR内参(GAPDH)、基因引物序列(见表1)
阅读提示:Methods部分 'Histological analysis and qRT-PCR'