体外细胞模型建立与处理
建立Ang II诱导的H9C2心肌细胞肥厚模型,并评估硅酸盐离子(CS提取物)对心肌细胞肥厚的影响。
H9C2细胞以指定密度接种,用1 μM Ang II处理48小时,同时加入或不加入CS提取物(1/16稀释);检测细胞大小、肥厚基因表达和细胞内钙水平。
Silicate Ions Derived from Calcium Silicate Extract Decelerate Ang II-Induced Cardiac Remodeling.
包含体外H9C2细胞模型和体内Ang II诱导小鼠模型、超声心动图、组织学、分子表达等多项验证,及功能验证(基因表达、细胞内钙、心功能)和机制探讨(钙信号、血管生成)。
H9C2大鼠心肌细胞系 Ang II诱导的心脏肥厚小鼠模型(C57/BL6J小鼠)
硅酸钙提取物浓度:体外实验使用1/16稀释度,体内使用硅酸盐离子浓度77.6 μg/mL Ang II处理条件:体外1 μM处理48小时;体内1000 ng/kg/min持续泵入28天 动物实验分组:Saline对照、Ang II+Saline、Ang II+CS,静脉注射7次,隔天一次 心功能指标:LVEF、LVFS、LVPW;s等通过Vevo 3100测量
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立Ang II诱导的H9C2心肌细胞肥厚模型,并评估硅酸盐离子(CS提取物)对心肌细胞肥厚的影响。
H9C2细胞以指定密度接种,用1 μM Ang II处理48小时,同时加入或不加入CS提取物(1/16稀释);检测细胞大小、肥厚基因表达和细胞内钙水平。
建立Ang II诱导的心脏肥厚小鼠模型,并评估静脉注射硅酸盐离子对心脏肥厚和心脏功能的影响。
8周龄雄性C57/BL6J小鼠皮下植入含Ang II的Alzet渗透压泵(1000 ng/kg/min),持续28天;在14天内隔天静脉注射100 μL含硅酸盐离子的生理盐水或生理盐水对照共7次;通过超声心动图、血压测量、组织学分析、qPCR等评估效果。
评估硅酸盐离子对Ang II诱导心脏肥厚小鼠心脏功能和血压的影响。
使用Vevo 3100小动物超声成像系统记录M型超声心动图,测量LVEF、LVFS、LVAW、LVPW等参数;使用无创血压监测仪(BP-2010A)测量血压和心率。
评估硅酸盐离子对心肌肥厚和血管生成的组织学及分子水平影响。
心脏组织固定、包埋、切片,进行H&E染色、WGA染色(评估心肌细胞大小)、CD31免疫荧光染色(评估毛细血管密度);通过qRT-PCR检测肥厚相关基因(ANP、BNP、β-MHC)和血管生成相关基因(VEGF、bFGF、KDR)的表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CS提取物制备 | 硅酸钙(CS)粉末 | Kunshan Chinese Technology New Materials Co., Ltd | -- |
| 细胞培养 | 达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM) | -- | -- |
| CS提取物制备 | 0.22 μm过滤器 | Millipore | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | -- | -- |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 免疫荧光染色 | 山羊血清 | -- | -- |
| 吐温20 | -- | -- | |
| 心肌肌钙蛋白I(cTnI)抗体 | Proteintech | 15513-1-AP | |
| Cy3标记的亲和纯化山羊抗兔IgG (H+L) | Proteintech | SA00009-2 | |
| DAPI | Solarbio | C0065 | |
| 尼康A1共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| qRT-PCR | RNA提取试剂盒 | YEASEN | M3211070 |
| 超微量分光光度计 | DeNovix | DS-11 | |
| Hifair®III第一链cDNA合成预混液(qPCR) | YEASEN | H6201080 | |
| Hieff® qPCR SYBR® Green预混液(无Rox) | YEASEN | H7101190 | |
| 细胞内钙测量 | Fluo-4AM | Solarbio | F8500 |
| Hank's平衡盐溶液 | Servicebio | G4203 | |
| Hank's平衡盐溶液 | Servicebio | G4210 | |
| HEPES缓冲液 | -- | -- | |
| 动物实验 | Alzet渗透压泵 | DURECT Corporation | Model 2004 |
| 超声心动图 | Vevo 3100小动物超声成像系统 | VisualSonics | -- |
| 血压测量 | 无创血压监测仪 | Softron | BP-2010A |
| 组织学分析 | 麦胚凝集素(WGA) | Shanghai source leaf | S25064 |
| 抗CD31抗体 | Servicebio | GB11063-2 | |
| 荧光显微镜 | Carl Zeiss | Axio Vert.A1 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 7 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CS提取物制备 | CS粉末与无血清DMEM或生理盐水的料液比(1:5 g/mL)、振荡条件(120 rpm/min,37°C,24h)、离心条件(4000 rpm/min,5min)、过滤(0.22μm)、稀释比例(体外1/16) 阅读提示:Methods部分 'Preparation of CS extract' |
| 体外细胞实验 | H9C2细胞密度(2×10^3或3×10^4细胞/孔)、Ang II浓度(1μM)、处理时间(48h)、CS提取物稀释比例(1/16) 阅读提示:Methods部分 'Cell Culture'、'Immunofluorescent staining of cTnI'、'Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis' |
| 动物模型建立与干预 | 小鼠品系(C57/BL6J)、年龄(8周龄)、性别(雄性)、Ang II剂量(1000 ng/kg/min)、泵入时间(28天)、CS给药方式(静脉注射100μL,7次,隔天一次)、分组(Saline、Ang II+Saline、Ang II+CS) 阅读提示:Methods部分 'Animal and treatment' |
| 心脏功能评估 | 超声系统(Vevo 3100)、探头频率(30-MHz)、麻醉方式(异氟醚)、测量参数(LVEF、LVFS、LVAW、LVPW等)、连续心动周期数(3个) 阅读提示:Methods部分 'Echocardiographic measurements' |
| 血压测量 | 测量时间点(7、14、28天)、设备(BP-2010A)、指标(收缩压、舒张压、平均压、心率) 阅读提示:Methods部分 'Blood Pressure (BP) measurements' |
| 组织学与分子分析 | 组织固定(4%PFA)、切片厚度(5μm)、WGA浓度(10μg/mL)、CD31抗体(GB11063-2)、qPCR内参(GAPDH)、基因引物序列(见表1) 阅读提示:Methods部分 'Histological analysis and qRT-PCR' |