观察CD36的节律性表达
检测CD36在肝脏中的昼夜节律表达模式。
通过qRT-PCR和Western blot检测CD36flox/flox小鼠肝脏中CD36 mRNA和蛋白水平随时间的变化，并分析光照和进食限制对CD36表达的影响。
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CD36调节小鼠的日常葡萄糖代谢和肝脏时钟以维持葡萄糖稳态。
CD36 regulates diurnal glucose metabolism and hepatic clock to maintain glucose homeostasis in mice.
实验完整度
高包含体内外实验、动物模型、行为监测、分子机制验证等多层次证据。
主要模型
小鼠肝脏 HepG2细胞 NIH3T3细胞
重点核对
CD36在肝脏中的节律性表达 Per1基因的昼夜节律振幅 胰岛素信号通路活性 FoxO1的亚细胞定位及Per1转录调控 AKT激动剂SC79的体内干预效果
摘要
内分泌学；肝病学；分子生物学
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CD36是否以及如何调节肝脏时钟和血糖稳态？
- 核心机制
- CD36通过维持胰岛素信号通路（CD36与IRβ结合），抑制FoxO1核转位，从而抑制Per1转录，维持肝脏时钟的正常节律。
- 主要证据
- 通过CD36-LKO小鼠和siCD36细胞模型，发现CD36缺失导致胰岛素信号减弱、FoxO1核转位增加、Per1表达升高、昼夜节律紊乱，而AKT激动剂SC79可恢复这些异常。
- 研究意义
- 该研究首次揭示CD36是昼夜节律振荡器的关键调控因子，其缺乏可能加重代谢疾病，为代谢疾病的时辰治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估CD36缺失对行为节律的影响
验证肝脏CD36缺失是否扰乱小鼠的昼夜行为节律。
使用TSE代谢笼监测CD36flox/flox和CD36-LKO小鼠48小时的食物摄入、饮水、自主活动和运动距离，并计算昼夜比。
分析CD36缺失对血糖和胰岛素敏感性的影响
检测CD36缺失是否破坏血糖和胰岛素敏感性的昼夜节律。
在不同ZT时间点测定血清葡萄糖、胰岛素等激素水平，并进行GTT和ITT实验，以及检测胰岛素信号通路蛋白磷酸化水平。
评估CD36对肝糖异生的昼夜调控
明确CD36是否影响糖异生相关基因的昼夜节律表达。
通过qRT-PCR和Western blot检测肝脏糖异生关键基因的表达，并进行PTT和禁食实验评估糖异生效率。
研究CD36缺失对FoxO1和Per1亚细胞定位的影响
探究CD36缺失是否改变FoxO1和Per1的核转位。
利用免疫组织化学和细胞实验，在CD36-LKO小鼠肝脏及siCD36细胞中观察FoxO1和Per1的核定位，并给予SC79处理验证AKT通路的作用。
验证FoxO1对Per1转录的直接调控
证明FoxO1直接结合Per1启动子并促进其转录。
通过JASPAR预测并结合ChIP实验验证FoxO1在Per1启动子上的结合位点，同时利用siFoxO1敲低观察Per1表达变化。
干预AKT-FoxO1通路恢复肝脏时钟和行为节律
评估激活AKT能否挽救CD36-LKO小鼠的时钟和节律紊乱。
给CD36-LKO小鼠注射SC79，检测肝脏时钟基因表达、亚细胞定位和昼夜行为参数，验证通路相关性和治疗潜力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | CD36抗体 | Novus | NB400-144 |
| Per1抗体 | LifeSpan | LS-C807611 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691S | |
| p-AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060S | |
| PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | 4257T | |
| p-PI3K抗体 | GeneTex | GTX132597 | |
| FoxO1抗体 | Cell Signaling Technology | 2880S | |
| p-FoxO1抗体 | Cell Signaling Technology | 9461T | |
| G6pase抗体 | Santa Cruz | sc-167939 | |
| PEPCK抗体 | Santa Cruz | sc-32879 | |
| β-actin抗体 | Bioss | bs-0061R | |
| 免疫组织化学 | Per1抗体 | Proteintech | 13463-1-AP |
| 免疫荧光 | IRβ抗体 | Bioss | bs-0290R |
| 免疫共沉淀 | IRβ抗体 | Cell Signaling Technology | 3025s |
| Fyn抗体 | Abcam | ab184276 | |
| 药物处理 | SC79 | ApexBio | B5663 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | SH30243.01 |
| 细胞转染 | Lipofectamine RNAiMAX试剂 | Invitrogen | 13778150 |
| 细胞培养 | 供体马血清 | HyClone | SH30074.02 |
| RNA提取 | RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 |
| 免疫共沉淀 | 蛋白G磁珠 | Millipore | LSKMAGG02 |
| 酶联免疫吸附试验 | 小鼠胰岛素ELISA试剂盒 | Ruixinbio | rx202485m |
| 小鼠葡萄糖ELISA试剂盒 | Ruixinbio | rxwb438 | |
| 小鼠瘦素ELISA试剂盒 | Ruixinbio | rx202629m | |
| 小鼠胰高血糖素ELISA试剂盒 | Ruixinbio | rx202477m | |
| 小鼠皮质酮ELISA试剂盒 | Ruixinbio | rxj202703m | |
| 逆转录 | PrimeScript逆转录试剂盒 | TaKaRa | RR047A |
| 亚细胞分级分离 | 核浆蛋白提取试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0027 |
| 染色质免疫沉淀 | EZ-Magna ChIP A/G染色质免疫沉淀试剂盒 | Millipore | 17-10086 |
| 仪器设备 | TSE PhenoMaster代谢笼 | TSE Systems | -- |
| 显微镜 | Leica TCS SP8共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物实验 | CD36flox/flox和CD36-LKO小鼠的遗传背景、性别（雌性）、年龄（8-12周龄）、饲养条件（12h光照/12h黑暗，25°C，SPF环境） 阅读提示：STAR★Methods: Animals and treatments |
| 细胞实验 | HepG2（ATCC HB-8065）和NIH3T3（BNCC100843）细胞的来源和培养条件（DMEM+10%FBS，37°C，5%CO2） 阅读提示：STAR★Methods: Cell line and culture |
| 基因敲低 | siRNA序列（siCD36, siFoxO1, siPer1）及转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX）的使用浓度和方法 阅读提示：STAR★Methods: Cell line and culture; Table S1-S2 |
| 血清休克 | 50%马血清（HyClone）处理2小时，记录培养基（DMEM+1%FBS），取样时间点（12-30小时，每6小时） 阅读提示：STAR★Methods: Cell line and culture |
| 代谢表型分析 | TSE PhenoMaster代谢笼的适应期（2周），监测时间（48小时），监测参数（食物摄入、饮水、活动、VO2、VCO2等） 阅读提示：STAR★Methods: Metabolic profiling studies |
| 糖耐量试验 | 禁食时间（12小时），葡萄糖剂量（1g/kg），血糖检测时间点（0,15,30,60,90,120分钟） 阅读提示：STAR★Methods: Glucose tolerance test (GTT) |
| 胰岛素耐量试验 | 禁食时间（4小时），胰岛素剂量（0.75 U/kg），血糖检测时间点（0,15,30,60,90,120分钟） 阅读提示：STAR★Methods: Insulin tolerance test (ITT) |
| 丙酮酸耐量试验 | 禁食时间（16小时），丙酮酸剂量（2g/kg），血糖检测时间点（0,15,30,60,90,120分钟） 阅读提示：STAR★Methods: Pyruvate tolerance test (PTT) |
| AKT激动剂处理 | SC79浓度（40 mg/kg），注射方式（腹腔注射），处理时间（12小时） 阅读提示：STAR★Methods: Animals and treatments |
| 分子检测 | 抗体信息（品牌和货号）及稀释比例，Western blot、qRT-PCR、ChIP的具体步骤 阅读提示：STAR★Methods: Western blotting, RNA extraction and RT-qPCR, Chromatin immunoprecipitation |