临床样本和数据库分析KLHL7表达与预后
探究KLHL7在肝细胞癌中的表达水平及其与患者预后的关系。
利用TCGA和UALCAN等公共数据库分析KLHL7 mRNA在HCC组织与正常组织中的表达，并分析其与分期、总生存期和无进展生存期的关联；通过免疫组化检测HCC组织和癌旁组织中KLHL7蛋白表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
KLHL7通过降解RASA2促进肝细胞癌进展和分子治疗耐药
KLHL7 promotes hepatocellular carcinoma progression and molecular therapy resistance by degrading RASA2.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内异种移植瘤模型、患者组织样本分析及机制验证（泛素化、RAS-MAPK通路）等多个独立证据层级。
主要模型
Huh-7细胞 HCCLM3细胞 Hep3B细胞 BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型
重点核对
KLHL7在HCC组织和细胞系中的表达水平 KLHL7敲低或过表达对细胞活力、克隆形成和体内肿瘤生长的影响 KLHL7对RASA2蛋白稳定性、K48泛素化和蛋白酶体降解的影响 KLHL7对RAS-MAPK通路（ERK1/2、MEK1磷酸化及GTP-RAS水平）的影响 KLHL7敲低联合乐伐替尼处理在体内外对肿瘤生长的抑制作用
摘要
肝细胞癌（HCC）是一种常见的侵袭性肿瘤，预后不良，患者通常对治疗药物似乎难以应答。在本研究中，我们发现KLHL7在HCC中表达上调，且与患者预后不良相关。体外和体内实验均发现KLHL7促进HCC发展。机制上，RASA2（一种RAS GAP）被鉴定为KLHL7的底物。生长因子上调KLHL7促进RASA2的K48连接的多聚泛素化，通过蛋白酶体途径降解。我们的体内实验显示，抑制KLHL7联合乐伐替尼治疗可有效杀伤HCC细胞。总之，这些发现证明了KLHL7在HCC中的作用，并揭示了生长因子调节RAS-MAPK通路的机制。它代表了HCC的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KLHL7在肝细胞癌中的表达、功能及其在肿瘤进展和分子治疗耐药中的机制是什么？
- 核心机制
- KLHL7作为BCR E3泛素连接酶复合物的底物识别亚基，通过促进RASA2的K48连接多聚泛素化并经蛋白酶体途径降解RASA2，从而增强RAS-MAPK信号通路激活，促进HCC进展和分子治疗耐药。
- 主要证据
- 体外实验显示KLHL7敲低抑制Huh-7和HCCLM3细胞活力、克隆形成及体内肿瘤生长，过表达促进Hep3B细胞增殖；机制上，Co-IP和免疫荧光证实KLHL7与RASA2相互作用，泛素化实验证明KLHL7促进RASA2 K48泛素化，CHX实验显示KLHL7缩短RASA2蛋白半衰期；患者组织分析显示KLHL7高表达与RASA2低表达及ERK磷酸化升高相关。
- 研究意义
- 研究表明KLHL7可能是肝细胞癌的潜在治疗靶点，抑制KLHL7可增强乐伐替尼等分子治疗药物的疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞功能实验验证KLHL7的致癌作用
验证KLHL7对肝细胞癌细胞活力、增殖和克隆形成的影响。
在Huh-7和HCCLM3细胞中敲低KLHL7，在Hep3B细胞中过表达KLHL7，通过CCK-8细胞活力实验和克隆形成实验检测细胞增殖能力，并评估药物敏感性。
体内异种移植瘤模型验证KLHL7对肿瘤生长的影响
在体内验证KLHL7敲低对肿瘤生长的影响。
将shKLHL7或对照HCCLM3细胞皮下接种至裸鼠，测量肿瘤体积和重量。
RAS-MAPK通路活性检测
探究KLHL7对RAS-MAPK信号通路活性的影响。
在KLHL7敲低或过表达的HCC细胞中，通过Western blot检测ERK1/2和MEK1磷酸化水平，并通过GST-RAF1-RBD pulldown检测GTP-RAS水平。
验证KLHL7与RASA2的相互作用及泛素化降解
验证KLHL7是否与RASA2相互作用并通过泛素化途径降解RASA2。
通过Co-IP、免疫荧光验证KLHL7与RASA2的相互作用；在293T细胞中共表达KLHL7和RASA2，检测RASA2蛋白水平，并用MG132和CHX处理验证蛋白酶体依赖的降解；通过体内泛素化实验检测RASA2的K48连接泛素化。
验证RASA2介导KLHL7的功能效应
验证KLHL7促进肿瘤生长和耐药是否依赖于RASA2。
在Huh-7和HCCLM3细胞中同时敲低KLHL7和RASA2，检测RAS-MAPK通路活性、细胞活力、软琼脂克隆形成和乐伐替尼敏感性。
体内验证KLHL7抑制联合乐伐替尼的治疗效果
验证在体内抑制KLHL7是否能增强乐伐替尼对HCC的疗效。
使用HCCLM3细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，给予乐伐替尼口服处理，比较shKLHL7与对照组的肿瘤生长，并通过免疫组化检测肿瘤组织中KLHL7、RASA2和P-ERK1/2水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹/免疫组化/免疫荧光 | 抗KLHL7抗体 | Sigma-Aldrich | HPA029491 |
| 免疫印迹/免疫组化 | RASA2兔多克隆抗体 | ABclonal | A18375 |
| 磷酸化p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4376 | |
| 免疫印迹 | 磷酸化MEK1/2 (Ser217/221) (41G9)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9154 |
| p44/42 MAPK (Erk1/2)抗体 | Cell Signaling Technology | 3510 | |
| MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9122 | |
| KRAS+HRAS+NRAS兔单克隆抗体 | ABclonal | A19779 | |
| 免疫印迹/免疫荧光 | 单克隆抗FLAG M2抗体 | Sigma-Aldrich | F4049 |
| 免疫印迹 | DYKDDDDK标签 (D6W5B) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 70569 |
| 小鼠抗Myc标签单克隆抗体 | ABclonal | AE010 | |
| HA标签 (26D11) 单克隆抗体 | Abmart | M20003 | |
| GST标签 (12G8) 单克隆抗体 | Abmart | M20007 | |
| 组织芯片 | 组织芯片1 | SHANGHAI OUTDO BIOTECH | HLiv-HCC030PG-01 |
| 组织芯片2 | SHANGHAI OUTDO BIOTECH | HLiv-SP041 | |
| 药物处理 | MG132 | Selleck | S2619 |
| 蛋白纯化 | 链霉亲和素琼脂糖树脂 6FF | YEASEN | 20512ES08 |
| 动物实验 | 基质胶基底膜基质 | Corning | 356234 |
| 蛋白纯化 | GSTSep谷胱甘肽琼脂糖树脂 4FF | YEASEN | 20508ES10 |
| 药物处理 | 甲磺酸乐伐替尼 | GLPBIO | GC36438 |
| 甲苯磺酸索拉非尼 | GLPBIO | GC16499 | |
| 细胞培养 | Hep3B细胞系 | Procell | CL-0102 |
| HepG2细胞系 | Procell | CL-0103 | |
| Huh-7细胞系 | Procell | CL-0120 | |
| HCCLM3细胞系 | Qiao Xin Zhou Biotechnology | ZQ0023 | |
| HEK293T细胞系 | Chinese Academy of Sciences | SCSP-502 | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Charles River | 194 |
| 质粒构建 | pcDNA3.1 (+) 载体 | Invitrogen | V79020 |
| pLKO.1 puro载体 | addgene | Plasmid #8453 | |
| 慢病毒包装 | pMD2.G | addgene | Plasmid #12259 |
| psPAX2 | addgene | Plasmid #12260 | |
| 泛素化实验 | pRK5-HA-泛素-野生型 | addgene | Plasmid #17608 |
| pRK5-HA-泛素-K63 | addgene | Plasmid #17606 | |
| pRK5-HA-泛素-K48 | addgene | Plasmid #17605 | |
| GST pulldown | Raf-1 GST RBD 1-149 | addgene | Plasmid #13338 |
| 质粒构建 | pLKO.1-blast载体 | addgene | Plasmid #26655 |
| pLVX-IRES-Puro(Flag-SBP)载体 | This paper | -- | |
| pLV-Ubc-MCS-IRES-Bsd载体 | This paper | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基、10% FBS、37°C、5% CO2 阅读提示：STAR★Methods, Cell lines and transfections |
| 质粒转染 | 转染试剂：jetOPTIMUS (Polyplus) 阅读提示：STAR★Methods, Cell lines and transfections |
| 敲低与过表达 | shRNA序列：shKLHL7(1): TCATCAGTGAAGCGCAGTATC; shKLHL7(2): CTGCTAGAATTTCCGTGAATA; shRASA2: GAATCTGCGCTACTATGTAGA；基因表达载体：pLV-Ubc-MCS-IRES-Bsd 阅读提示：STAR★Methods, Plasmid |
| 动物实验 | 6周龄雄性BALB/c裸鼠，5×10^6细胞皮下接种，乐伐替尼10 mg/kg口服每周5次，肿瘤体积约100 mm^3时开始给药，肿瘤体积公式length×width^2/2 阅读提示：STAR★Methods, Experimental model and subject details |
| 免疫组化 | 抗体稀释度：KLHL7 1:100, RASA2 1:100, P-ERK1/2 1:50 阅读提示：STAR★Methods, Patient specimens and tissue microarrays |
| 泛素化实验 | HA-Ubiquitin质粒（WT、K48、K63），转染后48小时裂解，SBP标签蛋白用链霉亲和素珠子富集 阅读提示：STAR★Methods, Ubiquitination assay |
| GST-RAF1 RBD pulldown | GST-RBD (10 μg)，4°C孵育60 min 阅读提示：STAR★Methods, GST-RAF1 RBD pulldown |
| 克隆形成实验 | 1000细胞/孔种于12孔板，处理2周，100%甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色 阅读提示：STAR★Methods, Colony formation assays |
| 软琼脂克隆形成实验 | 底层0.6%低熔点琼脂，上层0.35%低熔点琼脂含2000细胞，培养3周 阅读提示：STAR★Methods, The soft agar colony formation assay |
| 细胞活力实验 | 96孔板，10% CCK-8孵育30 min，450 nm吸光度 阅读提示：STAR★Methods, Cell viability assays |
| 实时荧光定量PCR | TRIzol提取RNA，逆转录试剂和qPCR mix来自Vazyme，引物序列见STAR★Methods 阅读提示：STAR★Methods, Real-time PCR |