生物信息学分析
基于TCGA数据库分析TIGIT在泛癌及乳腺癌中的表达和预后相关性。
从TCGA获取33种泛癌及1376例浸润性乳腺癌样本数据，分析TIGIT表达差异及其与生存期的关系。
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TIGIT在原发性乳腺癌中的表达及其临床意义
Expression and Clinical Significance of TIGIT in Primary Breast Cancer.
实验完整度
中包含数据库分析、细胞系、临床样本检测及相关性分析，但缺乏功能验证和机制实验。
主要模型
乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231 正常乳腺上皮细胞系MCF-10A 原发性乳腺癌患者外周血和组织样本
重点核对
TCGA数据库中TIGIT在乳腺癌组织中的表达上调，并与分期和预后相关 乳腺癌细胞系和正常细胞系中TIGIT蛋白和mRNA表达差异 56例乳腺癌患者和34例健康对照外周血T细胞中TIGIT水平比较 IHC检测肿瘤组织和癌旁组织中TIGIT阳性率 术前术后外周血TIGIT水平变化
摘要
目的：T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白（TIGIT）在原发性乳腺癌（PBC）诊断中的作用仍不清楚。本研究旨在探讨TIGIT在PBC患者中的表达，并分析其在PBC中的诊断价值。患者与方法：我们首先基于TCGA数据库探讨癌症患者中TIGIT的表达，然后分析其与临床病理特征的相关性。随后，我们比较了两种乳腺癌细胞系（MCF-7和MDA-MB-231）和正常乳腺上皮细胞系（MCF-10A）中TIGIT的蛋白和mRNA表达。随后，纳入了2018年10月至2021年6月泰州市人民医院收治的56例PBC女性患者。采用流式细胞术检测PBC患者和健康对照者外周血CD3+ T细胞上的TIGIT水平。通过免疫组化和免疫荧光染色检测PBC组织中TIGIT的表达。结果：TCGA数据库显示，与癌旁组织相比，TIGIT在肿瘤组织中显著上调。高TIGIT表达与肿瘤分期正相关，与无复发生存期和总生存期负相关。乳腺癌细胞系、PBC患者外周血和肿瘤组织中TIGIT水平显著高于对照组（P < 0.05）。TIGIT水平与年龄相关（P < 0.05），而与肿瘤大小、病理类型、淋巴结转移、ER、PR、HER-2和P53无关。ROC曲线显示，外周血TIGIT用于乳腺癌筛查的最佳临界值为23.38%。术后外周血TIGIT水平较术前显著降低（P < 0.05）。结论：TIGIT在PBC中表达上调，且与年龄相关。它可能是PBC诊断和免疫治疗的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究TIGIT在原发性乳腺癌中的表达情况及其诊断价值。
- 核心机制
- TIGIT可能参与肿瘤免疫逃逸，导致T细胞耗竭和功能障碍，从而促进乳腺癌进展。
- 主要证据
- TCGA数据库显示肿瘤组织中TIGIT高表达，与不良预后相关；细胞系和临床样本中TIGIT表达上调，且外周血水平具有诊断价值，术后下降。
- 研究意义
- TIGIT可能成为乳腺癌诊断和免疫治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞系中TIGIT表达检测
比较乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞系中TIGIT的蛋白和mRNA表达差异。
培养MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A细胞，采用Western blot和qRT-PCR检测TIGIT表达。
患者样本收集与TIGIT表达检测
检测乳腺癌患者肿瘤组织和外周血中TIGIT表达，并与健康对照比较。
收集56例PBC患者肿瘤组织和外周血，34例健康对照外周血，通过IHC、免疫荧光和流式细胞术检测TIGIT表达。
临床病理相关性分析
分析外周血TIGIT水平与临床病理特征的相关性。
比较不同年龄、肿瘤大小、病理类型、淋巴结转移、ER、PR、HER-2、P53等亚组间TIGIT水平。
诊断价值评估
评估外周血TIGIT水平对乳腺癌的诊断价值。
绘制ROC曲线，计算曲线下面积、最佳临界值、敏感性和特异性。
手术前后变化分析
比较手术前后外周血TIGIT水平的变化，探讨其与肿瘤负荷的关系。
收集12例PBC患者术前和术后外周血，流式检测TIGIT水平，统计学比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA试剂盒 | Bioteke | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗TIGIT抗体 | Abcam | ab243903 | |
| 抗α-tubulin抗体 | Proteintech | 66031 | |
| HRP标记二抗 | -- | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Takara | -- |
| Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | FSQ-201 | |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Light Cycler 480 II系统 | Roche Diagnostics | -- | |
| IHC | 柠檬酸盐缓冲液 | -- | -- |
| Dako K5007试剂盒 | Dako | K5007 | |
| 抗TIGIT一抗 | Abcam | ab243903 | |
| DAB显色剂 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 抗TIGIT一抗 | CST | 99567 |
| 抗CD3一抗 | CST | 24265 | |
| 抗CD56一抗 | CST | 3576 | |
| 荧光二抗 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 抗CD3-FITC单克隆抗体 | BD | -- |
| 抗TIGIT-PE单克隆抗体 | BioLegend | -- | |
| FACS Calibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TCGA数据获取与分析 | TCGA数据库版本、样本筛选标准（291例癌旁、1085例肿瘤），分组方法（中位数分组） 阅读提示：Materials and Methods中的TCGA Data Collection部分及Results相关段落 |
| 细胞培养 | 细胞系来源（Procell）、培养基（RPMI 1640）、血清浓度（10%）、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods中的Cell Culture部分 |
| Western blot分析 | 抗体稀释度（TIGIT 1:4000，α-tubulin 1:10,000）、蛋白上样量（20 μg）、封闭条件（5%脱脂奶粉）、洗涤次数和时间 阅读提示：Materials and Methods中的Western Blot部分 |
| qRT-PCR分析 | 引物序列、反应条件（95°C 10分钟，95°C 30秒，60°C 30秒，72°C 30秒，40个循环） 阅读提示：Materials and Methods中的Quantitative Real Time PCR部分 |
| 患者样本收集 | 患者纳入与排除标准、样本数量（56例PBC，34例对照）、伦理批准号、知情同意 阅读提示：Materials and Methods中的Patients部分 |
| IHC实验 | 抗原修复液（柠檬酸盐缓冲液pH 6.0）、一抗稀释度（1:200）、孵育时间和温度、Dako K5007 kit使用 阅读提示：Materials and Methods中的IHC部分 |
| 免疫荧光染色 | 一抗种类及稀释度（TIGIT、CD3、CD56）、二抗种类及稀释度（A11008、A11012）、DAPI染色时间（10分钟） 阅读提示：Materials and Methods中的Immunofluorescent Staining部分 |
| 流式细胞术 | 抗体用量（CD3-FITC 5μL，TIGIT-PE 2μL）、血液量（50μL）、孵育时间（15分钟，暗处）、溶血素处理（500μL，10分钟）、离心条件（1500rpm，5分钟） 阅读提示：Materials and Methods中的Flow Cytometry部分 |